[发明专利]一种拮抗土传病害的菌株及其筛选、鉴定方法和应用

权利要求书

1.一种拮抗土传病害的菌株，其特征在于：该菌为分离自醋醅的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），保藏编号为：CCTCC NO：M 20221003。

2.一种拮抗土传病害的菌株，其特征在于：该菌为分离自醋醅的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20221004。

3.根据权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：其基因组中含有羊毛硫肽的生物合成基因；其中，所述暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）的基因组序列如SEQNO.3所示，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的基因组序列如SEQ NO.4所示。

4.一种根据权利要求1或2所述的拮抗土传病害的菌株的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1）、取样稀释：在气温高于30℃时，取醋醅若干份，无菌水稀释，获得醋醅稀释液；

步骤2）、高温培养：将醋醅稀释液涂布于LB培养基上，并于40～60℃下静置过夜高温培养，筛除杂菌，从醋醅中分离出活性菌株；

步骤3）、纯化筛强：挑取高温培养分离出的活性菌株，进一步试管纯化培养，并进行尖孢镰刀菌抑制试验，筛选出抑菌活性最强的菌株。

5.根据权利要求4所述的拮抗土传病害的菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1）中，所述醋醅为恒顺醋醅，醋醅稀释液的浓度为0.15～0.25g/mL。

6.根据权利要求4所述的拮抗土传病害的菌株的筛选方法，其特征在于：步骤3）中，所述抑制试验包括如下子步骤：

步骤3-1）、制备尖孢镰刀菌悬液：挑取试管斜面的尖孢镰刀菌（F.oxysporum），于带玻璃珠的无菌培养水中摇匀过滤后，制成10⁶～10⁸cfu/mL浓度的尖孢镰刀菌悬液；

步骤3-2）、抑菌培养：取1mL步骤3-1）中制备的尖孢镰刀菌悬液展开涂布于TBA固体培养基平板表面；取纯化培养后的从醋醅中分离出的活性菌株菌悬液各50μL，滴注于涂布尖孢镰刀菌悬液TBA固体培养基平板的不同位置，37℃下静置培养2～3天，获得抑菌活性最强的菌株。

7.一种拮抗土传病害的菌株的鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法用于鉴定根据权利要求4所述的筛选方法获得的菌株所属的属或种；具体方法包括如下步骤：

步骤A）：使用细菌16s rDNA通用PCR扩增引物对27F和1492R，并进行PCR扩增获得PCR产物；所述引物对27F和1492R的序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；

步骤B）：将步骤A）中PCR扩增获得的单一特异性条带的PCR产物进行切胶纯化；

步骤C）：将步骤B）中切胶纯化后的PCR产物采用Sanger测序法进行双向测序，获得抑菌活性最强菌株的基因组序列；并通过与已知序列进行同源性比对确定所筛选的菌株所属的属或种。

8.一种根据权利要求1或2所述的拮抗土传病害的菌株的应用，其特征在于：用于制备农用微生物菌剂或生物有机肥。

9.根据权利要求8所述的拮抗土传病害的菌株的应用，其特征在于：所述用于制备农用微生物菌剂具体为：将权利要求1或2所述的菌株接种于HXBT01培养基中进行培养，待菌株密度生长到8～10亿cfu/mL时，再按一定比例加入稀释后的醋糟并辅以营养物质制成农用微生物菌剂。

10.根据权利要求8所述的拮抗土传病害的菌株的应用，其特征在于：所述用于制备生物有机肥具体为：将权利要求1或2所述的菌株接种于HXBT01培养基中进行培养，待菌株密度生长到0.15～0.25亿cfu/g时，按配方要求直接加入醋糟与菜籽饼的混合物中混合均匀制成生物有机肥。