[发明专利]一种流式分选单个有核细胞的方法

说明书

本发明公开了一种流式分选单个有核细胞的方法，包括：制备细胞悬浮液；加入DNA核酸荧光染料对细胞染色；在流式细胞仪上检测染色后的所述细胞悬浮液，分析所述DNA核酸荧光染料信号强度，选定单个有核细胞，排除非单个有核细胞，将所述DNA核酸荧光染料信号强度是所述单个有核细胞的DNA核酸荧光染料信号强度倍数的粘连细胞筛选排除；通过流式细胞仪精准分选出选定的所述单个有核细胞。通过上述方式，本发明所提供的流式分选单个有核细胞能够在流式细胞仪上排除粘连细胞造成的假象,精准识别单个有核细胞，更进一步地，分选得到真正单个有核细胞。

技术领域

本发明涉及生物学和医学技术领域，尤其是涉及一种流式分选单个有核细胞的方法。

背景技术

细胞是生命的基本单位，生物体内的每个细胞都是独一无二的，它在生物系统中占据特定的空间位置，具有相对独立的遗传体系和基因表达调控机制。通过细胞尤其是单细胞分析，可了解生物的多样性并用于疾病的精准诊断及指导治疗。

细胞的来源包括组织、脑脊液、胸水、腹水、羊水、血液等。因为外周血采集方便、对机体损害小，检测并获取外周血中的单个有核细胞，在肿瘤的早期诊断和治疗、产前诊断、免疫学研究等领域将有更广泛的应用和实际价值，单个细胞的图像分析是技术手段之一。

单细胞全基因组测序可检测点突变，评价基因的镶嵌现象在生理和疾病中的意义，确定肿瘤内基因的多样性对肿瘤发展和治疗反应的影响；单细胞转录组测序可分析单核苷酸的多态性及其与疾病发生发展的关系。

单细胞研究的迅速发展要求能精准识别且得到有效的单个有核细胞。如果获取的单细胞中污染了其他细胞，会得到错误的信息，比如导致基因识别错误。

对含量稀少的细胞而言(低至万分之一，甚至更低)，得到单细胞非常不易，更需要快速精准获取有效的单个有核细胞。

目前的流式细胞仪能快速分析并分选单个颗粒，但是并不能完全精准到一个有核细胞。在流式细胞仪上检测细胞悬浮液，流式细胞仪收集细胞悬浮液中每一个被检测颗粒的光学信号，根据所获得的光学信号了解每一个被检测颗粒的特性，并可将满足所需特性的颗粒分选出来。

但是在流式细胞仪检测过程中，会发生两个或多个细胞随机粘连的情况。如果两个或多个细胞随机粘连在一起，流式细胞仪可能会认为这是一个大的细胞，得出错误的分析结果，比如不同荧光染料A阳性和荧光染料B阳性的两个细胞粘连在一起，会显示为一个A和B双阳性的颗粒；比如一个荧光染料A阳性的细胞和一个荧光染料B阴性的两个细胞粘连在一起，会显示为A阳性的一个颗粒。具体见说明书附图2。如果两个或多个粘连颗粒作为单个细胞被分选出来，这样实际得到的不是单个有核细胞，而是多个粘连细胞的总和，导致后续的单细胞研究得出错误的结果。

现有技术中分选单个有核细胞的方法是在流式细胞仪上利用细胞被激发光照射后产生的散射光信号的宽度和高度或面积信号区别单个细胞和粘连细胞。当细胞通过流式细胞仪的激发光斑时，每个细胞会产生散射光的宽度信号(W)、高度信号(H)、面积信号(A)，部分粘连细胞与单个细胞相比，W、H或A信号不同。这种方法能去除一部分粘连细胞，但是不能排除所有的粘连细胞。这是因为一方面粘连细胞在细胞悬浮液流过流式细胞仪的检测区时细胞会随机旋转，在某些旋转角度下，利用散射光信号的W、H或A信号无法区分粘连细胞和单个细胞；另一方面，细胞体积大小不一，一个体积大的细胞和一个体积小的细胞粘连，利用散射光信号的W、H或A信号也难以区分出粘连细胞和单个细胞。具体见说明书附图3。

也就是说，现有的各种技术均无法精准地排除出所有粘连的有核细胞而精准获得单个有核细胞。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种流式分选单个有核细胞的方法，解决了现有技术中无法精准地排除出所有粘连有核细胞的技术问题。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

制备细胞悬浮液；

加入DNA核酸荧光染料对细胞染色；