[发明专利]一种生产2′-脱氧胞苷的重组微生物及方法

说明书

本发明提供了一种生产2'‑脱氧胞苷的重组微生物及方法，属于生物技术领域。本发明发现过表达非特异性的5'‑脱氧核苷酸酶YfdR(5'‑deoxynucleotidase)比文献报道的特异性的dCMP磷酸水解酶YfbR(dCMP phosphohydrolase)更利于提高2'‑脱氧胞苷的产量，且二者联用提高2'‑脱氧胞苷产量的效果更优。该重组微生物可用于2'‑脱氧胞苷的工业化生产，易于操作，从而达到绿色环保低成本生产2'‑脱氧胞苷的目的，为2'‑脱氧胞苷的生产提供了新的思路与方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产2′-脱氧胞苷的重组微生物及方法。

背景技术

2′-脱氧胞苷是一种以胞嘧啶为碱基的嘧啶2′-脱氧核糖核苷，由胞嘧啶和2′-脱氧核糖组成，分子式为C₉H₁₅N₃O₄，分子量为227.22，类白色粉末，易溶于水。2′-脱氧胞苷是一种重要的医药中间体，主要用于化学合成各种药物，如地西他滨(Dacogen^TM，5-氮杂-2′-脱氧胞苷)，用于治疗骨髓增生异常综合征(某些血细胞功能失调的一类疾病)和急性髓系白血病等。此外，2′-脱氧胞苷还被用来合成脱氧核苷酸的单体，以及制备寡聚脱氧核苷酸，广泛应用于核酸与基因工程中，如dNTP和各类引物等。

目前2′-脱氧胞苷主要是化学合成为主：以α-D-2-脱氧核糖和尿嘧啶为起始原料，经过甲苷化、酯化、氯代、亲核取代、高效氨化及水解脱保护等6个步骤，经一次重结晶得到目标物2′-脱氧胞苷。但是化学法生产2′-脱氧胞苷相对繁琐、成本高，且产物得率较低。与化学生产工艺相比，利用微生物生产2′-脱氧胞苷的成本效益较好，近年来逐渐成为热点。例如，Lee等人通过化学诱变构建基因工程产氨棒杆菌进行2′-脱氧胞苷的生产(Lee YB,Baek H,Kim SK,Hyun HH.et al.Deoxycytidine production by metabolicallyengineered Corynebacterium ammoniagenes.J Microbiol 49:53–57(2011))。此外，Kim等人通过敲除大肠杆菌BL21(DE3)基因组的deoA、udp、deoD、dcd、cdd、codA等一系列基因和过表达基因T4噬菌体来源的nrdBCA、yfbR及pyrG等基因进行2′-脱氧胞苷的生产(Kim,JS.,Koo,BS.,Hyun,HH.et al.Deoxycytidine production by a metabolically engineeredEscherichia coli strain.Microb Cell Fact 14,98(2015))。

然而，采用上述文献报道的重组微生物菌株发酵法生产2′-脱氧胞苷产量提高有限，且使用的质粒是中高拷贝，随着发酵时间延长存在质粒不稳定容易丢失的缺陷，此外还存在菌种放大的困难。因此，亟需寻找一种提高微生物发酵生产2′-脱氧胞苷的产量，且易于操作，可应用工业化生产的方法。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种生产2′-脱氧胞苷的重组微生物及方法。本发明意外发现过表达非特异性的5′-脱氧核苷酸酶YfdR(5′-deoxynucleotidase)比文献报道的特异性的dCMP磷酸水解酶YfbR(dCMP phosphohydrolase)更利于提高2′-脱氧胞苷的产量，而且二者联用进行共表达提高2′-脱氧胞苷产量的效果更优。该重组微生物可用于2′-脱氧胞苷的工业化生产，且易于操作，从而达到绿色环保低成本生产2′-脱氧胞苷的目的。

术语：

1、2′-脱氧胞苷：如无特殊说明，本发明中的英文简称“dCR”指2′-脱氧胞苷，其分子式为C₉H₁₅N₃O₄，分子量为227.22，结构式如下式(1)所示。