[发明专利]一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型

说明书

本发明提供一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型，利用SpRY‑CBE单碱基基因编辑技术进行ARPP21基因p.P521L位点突变构建一对寡聚核苷酸链。本发明提供的一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型通过对ARPP21基因P.P521L位点进行突变打靶，胚胎注射后进行胚胎移植，获得兔先天性高胰岛素血症模型，利用SpRY‑CBE基因编辑技术优势是没有识别PAM区域的序列限制，可以完成指定位点的突变顺利进行；克服了传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术需要识别PAM区域为NGG碱基序列，大部分突变位点无法进行编辑；本发明所利用的SpRY‑CBE碱基编辑技术首次在家兔上进行应用。该兔疾病模型不但能够有助于基础医学研究及机制探究，同时也是SpRY‑CBE碱基编辑系统首次在家兔动物中进行应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别的为一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症(ALS)简称渐冻症，是一种渐进性、神经退行性疾病，著名物理学家霍金就患此病。该病影响大脑和脊髓中的运动神经元，造成运动神经元死亡，令大脑无法控制肌肉运动，肌肉也会因缺乏运动而萎缩。尚无有效的治疗方案。

ARPP21基因编码cAMP调节的磷酸化蛋白。编码的蛋白质在尾状核和小脑皮层中富集。而小鼠中的类似蛋白质可能参与调节基底神经节中多巴胺的作用。交替剪接导致多个转录本变异。2020年研究表明ARPP21基因P.P521L位点突变可导致肌萎缩侧索硬化症。然而前期单碱基基因编辑技术有PAM限制及设计要求，而这个突变位点序列限制而无法完成，因此目前针对该突变位点还没有合适的动物模型。

发明内容

本发明提供的发明目的在于提供一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型以解决上述问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种构建新型肌萎缩侧索硬化症模型的方法及模型，

1)sgRNA表达载体的构建：

针对基因P.P521L位点设计1个sgRNA序列作用靶点，合成两条寡聚核苷酸链制备sgRNA，sgRNA的寡聚核苷酸链选取原则：选取突变碱基位置在5或6位的一条寡聚核苷酸链，其寡聚核苷酸为：

sgRNA-1-F：TAGGATATCCGGCGGTCTCTTTC；

sgRNA-1-R：AAACGAAAGAGACCGCCGGATAT；

两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链，退火条件是：95℃5min后自然降至室温，分BbsⅠ限制性核酸内切酶对PUC57载体线性化，随后将酶切产物进行回收，并将退火的sgRNA连接到PUC57载体上，进而完成PUC57-sgRNA载体的构建，如序列表SEQNO.3所示。

酶切37℃3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

2)SpRY-CBE mRNA的合成：SpRY-CBE表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；

酶切37℃3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

3)受精卵的获取和显微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好SpRY-CBE mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中SpRY-CBE mRNA浓度为150ng/μl，sgRNA浓度为30ng/μl；

4)受精卵的培养和发育：将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中。

本发明还提供了胚胎ARPP21基因敲除情况鉴定方法：