[发明专利]一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用。本发明质粒是以pACCRT‑EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来得到。本发明的克隆质粒不仅有抗性基因作为筛选基因，还插入了一段还插入了一段CrtE、CrtI、CrtB序列，该序列的存在可以使大肠杆菌呈现红色，因此在使用该发明进行克隆时，克隆成功菌落则为白色，否则呈现红色，可以通过直观的颜色变化有效减轻阳性菌的筛选工作量。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用。

背景技术

基因克隆技术，又名重组DNA技术，是指将目的基因片段插入到特定的质粒中形成重组质粒，进而实现目的基因的扩增、转录或翻译的一种基本分子生物学实验技术。

传统基因克隆技术步骤包括：选择目的片段并设计正反引物，使用引物扩增目的基因片段得到带有互补粘性末端或平末端的PCR片段，选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体，通过连接酶将PCR片段连接入克隆载体中重组成一个新的环状质粒，将质粒转化至大肠杆菌中便可以实现目的片段的克隆。在传统的基因克隆技术中，限制性内切酶消化和连接是分步进行的，导致耗时较长，并且使用不同限制性内切酶时还需要考虑到不同酶所需的缓冲液及反应温度均有所不同，则需要经过几步亚克隆过程才能获得最终所需的重组质粒，整个过程不仅繁琐还耗时。因此无缝克隆技术越来越受人们关注，Golden Gate克隆是现在较为常见的方法之一。

Golden Gate克隆的原理是在设计目的片段引物时，在目的片段的两端添加ⅡS型限制性内切酶识别位点，利用同一种限制性内切酶产生不同的粘性末端，从而实现目的片段的克隆。该方法的载体质粒不需要提前进行线性化处理，且可以在同一体系中进行限制性内切酶消化及连接，有效地提高片段连接的准确性。

目前现有的用于克隆的质粒载体较多，但仍存在一些缺点，较为普遍的便是少量连接酶将载体和载体被酶切的小片段错连及少连等，从而导致克隆效率不高，在克隆过程中会存在较多假阳性的出现，这对后期的阳性菌落筛选造成许多不便。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种用于无缝克隆的质粒。

本发明的另一目的在于提供上述用于无缝克隆的质粒的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述用于无缝克隆的质粒的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于无缝克隆的质粒，是通过将CrtE、CrtI、CrtB序列依次克隆到常规质粒中得到， CrtE、CrtI、CrtB序列两端含有相同的ⅡS型限制性酶位点；其中，CrtE序列如SEQ IDNO.1 第3124位～第4032位碱基所示，CrtI序列如SEQ ID NO.1第4217位～第5695位碱基所示， CrtB序列如SEQ ID NO.1第5691位～第6621位碱基所示。

进一步地，所述的ⅡS型限制性酶为BsaI、BsmBI或BbsI。

进一步地，所述的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述用于无缝克隆的质粒的构建方法，可以是按照SEQ ID NO.1所示序列进行人工合成，也可以是以pACCRT-EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来；其中：

用于扩增片段1的引物如下：

pDTK001 Part1-F：5’-AAGCGGTCTCCTGAcACGTTGATCGGCACGTA-3’

pDTK001 Part1-R：5’-AAGCGGTCTCCAcACGAAAAACATATTCTCAATAAACC-3’