[发明专利]一种不规则毛霉毒素蛋白序列及制备方法和应用

说明书

本发明提出了一种由不规则毛霉菌B50a菌株分离纯化的酵母重组蛋白、蛋白制品、制备方法及应用；申请人通过生物信息学技术进行同源基因比较，捕获了具有同源性的RLT‑B蛋白序列，并采用基因工程方法(重组质粒抽提、感受态电转化及阳性克隆筛选、筛选阳性克隆PCR鉴定、阳性克隆小量表达与鉴定和蛋白大量表达及分泌蛋白透析浓缩)获取其体外纯化的重组蛋白，经Western‑blotting方法检测蛋白质量为17KDa，经质谱法鉴定重组蛋白质量为16240.7Da。本发明主要应用于模拟毛霉菌感染过程中的外泌物质，便于体内外相关毒力研究的进一步开展，以及毛霉菌感染特征及机制的深入探索。

技术领域

本发明涉及一种不规则毛霉毒素蛋白序列及制备方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)是一种广泛存在的植物毒素，属于II型核糖体失活蛋白(RIP)，由A、B两条链构成，A链(RTA)具有使核糖体失活的能力，是毒性链；B链(RTB)为结合链，是一种半乳糖凝集素(Galectin)结合蛋白，可结合靶细胞并诱导细胞损伤。蓖麻毒素样蛋白基因存在于多种病原微生物中，在根孢囊霉(Rhizophagus)、德氏根霉(Rhizopusdelemar)、链球菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Paenibacillus)等中发现的RLT蛋白存在同源性，且均具有生物学毒力。

申请人多年来对根毛霉菌致病毒力的基因组学开展了较为深入的研究，同时发现MI上清液可导致HUVECs损伤，提示MI可能分泌相关毒力因子损伤血管内皮。为明确MI外泌因子成分，申请人通过查阅文献并结合基因组信息学分析结果(流程图如图1)，预测了其编码的蓖麻毒素B链同源蛋白(Ricin-Like toxin B-Chain，RLT-B)。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种由不规则毛霉菌B50a菌株分离纯化的酵母重组蛋白、蛋白制品、制备方法及应用。

本发明的技术解决方案是这样实现的：一种不规则毛霉毒素蛋白序列，菌种编号为CAMS-CCPM-D B50a；菌种名称为不规则毛霉(Mucor irregularis，MI)B50a；

其氨基酸序列如下：

MSLYFIRSQYNGRVLDVNDGSLEDGAEIIVWSQKGSDDCLNQLWRIEDGYIVNAKSAKALDISGGEMEPESAIIQYRQKSIEEAANQRWGIDSEGYIYSEARPDLVLDIQGREDEDGTPIILYNKREGEVASNQRWTLEEFQG。

其菌株DNA序列如下：

ATGTCCTTGTATTTTATCAGAAGTCAATATAACGGTCGTGTCCTTGATGTCAACGATGGCTCCCTCGAGGACGGTGCCGAAATTATCGTCTGGTCTCAAAAGGGAAGCGATGATTGCTTGAACCAATTGTGGCGTATTGAAGATGGCTACATTGTCAACGCCAAGTCTGCTAAGGCCCTCGATATCAGTGGTGGTGAAATGGAACCCGAATCTGCTATTATTCAATACCGTCAAAAGAGTATCGAAGAGGCTGCCAACCAAAGATGGGGTATTGATTCCGAAGGTTATATTTACAGCGAGGCTCGCCCTGACTTGGTTTTGGATATTCAAGGCCGTGAAGATGAAGATGGTACCCCTATCATCTTGTATAACAAACGCGAAGGCGAAGTTGCCTCCAACCAACGTTGGACTCTTGAGGAATTCCAAGGTTAA。

不规则毛霉毒素蛋白序列的制备方法，包含如下过程：重组质粒的大量抽提，感受态电转化及阳性克隆筛选，筛选阳性克隆PCR鉴定，阳性克隆小量表达与鉴定，蛋白大量表达及分泌蛋白透析浓缩，重组蛋白纯化以及WB检测。