[发明专利]一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法

说明书

本发明提供了一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法，利用怀孕大熊猫和未怀孕大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Markers，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Markers进行定量检测。从分子生物学层面上检验大熊猫怀孕情况。

技术领域

本发明涉及检验大熊猫怀孕早期的分子评估方法。

背景技术

大熊猫是中国珍稀保护动物，同时也是世界生物多样性保护的旗舰物种。在哺乳动物中，大熊猫有最小的幼体-母体体重比，可达到1:900，幼体体重特别小，生产的幼体记录最小的只有42.8g，大熊猫母兽怀孕后，即使在妊娠晚期，也很难根据母体体重变化和形态变化判断母体大熊猫是否怀孕。而且大熊猫配种后有延迟着床的现象，产前几个月几乎没有任何变化，只是在即将临产时有减食现象，因此判断大熊猫是否怀孕、尤其是怀孕早期判断特别困难，这不利于妊娠大熊猫的健康保健。

发明内容

本发明为了判断大熊猫是否怀孕，提供了一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法，从分子生物学层面上检验大熊猫是否怀孕。

本发明在研究中发现，大熊猫配种怀孕成功后，免疫特性有较大改变，几个免疫相关的基因在大熊猫受孕后1个月内即怀孕早期特异高表达，可以用来检测和判断大熊猫是否怀孕，尤其是早期怀孕的判断。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法，利用怀孕大熊猫和未怀孕大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Markers，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Markers进行定量检测。

本发明所述PCR扩增用到的专用引物：

Marker1（NOTCH1）：正向引物 5’- TGGTGCCGAACCAGTACAAC -3’

反向引物 5’- CCGAGCTCACGCCGAG -3’；

Marker2（DVL2-2）：正向引物 5’- TGGGAGACTCAGACGAGGATG -3’

反向引物 5’-AGCGTGACCGTGATGATGTT-3’；

Marker3（MAL3-3）：正向引物 5’- TGCTTGCGATGGGAGTTT -3’

反向引物 5’- ACCGTTGACAGGAAGTTTGA -3’；

Marker4（NOTCH3）：正向引物 5’- ACAGCACCCTCTGGTTCCC -3’

反向引物 5’- GCTCCTCTACCTTCAGTCGCTTA -3’

本发明所述实时荧光定量PCR扩增的内参基因（GAPDH）的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

本发明检验大熊猫怀孕早期的分子方法，包括以下步骤：

A、取待测怀孕大熊猫的血液组织样本与未怀孕大熊猫组的血液组织样本，分离出外周血单核细胞；

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA;

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、专用引物、去离子水配置成qPCR反应体系，qPCR反应使用荧光PCR操作平台；

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

E、基于T检验获得圈养大熊猫组每个Marker基因的2^−∆∆Ct置信区间；

F、将待测怀孕大熊猫个体的每个基因的2^−∆∆Ct值，与未怀孕大熊猫组每个Marker基因表达的置信区间进行比较，若均大于置信区间的上限值，则认为大熊猫怀孕早期。