[发明专利]一种君迁子种子消毒及再生培养的方法

说明书

本发明提供了一种君迁子种子消毒及再生培养的方法。包括种子消毒、胚轴诱导不定芽、叶片诱导不定芽等过程。本发明具有萌发率高，繁殖速率快，诱导效果显著的优点，不仅为快速繁殖优良君迁子无菌苗提供了一条途径，而且为君迁子的工厂化育苗及以后转基因技术提供可能。

技术领域

本发明属于君迁子组织培养领域，具体涉及一种君迁子种子消毒及再生培养的方法。

背景技术

君迁子(Diospyros lotus L.)为柿树科(Ebenaceae柿属(Diospyros L.)植物的一个种，别名黑枣、软枣、牛奶枣、丁香柿、高加索柿等。落叶乔木，树干挺直，树冠圆整，适应性强，亦可作园林绿化用。原产于亚洲西南部，欧洲东南部，目前分布于从东亚到地中海西部各国的广大区域。在我国的分布仅次于柿，除广东、广西、福建、新疆、青海、宁夏、内蒙、吉林、黑龙江等9省外，均有生长，垂直分布达海拔2 200m以上，是我国柿属植物中分布最高和最耐寒的一种。君迁子主要用做柿品种的砧木，抗寒、耐旱性强，与大多数柿品种亲和性强。君迁子的种子可以入药，能消渴去热。果实去涩生食或酿酒、制醋，也可提取供医用。因此，君迁子的价值越来越被人们所重视。君迁子在自然环境下生长缓慢，主要通过直接播种来种植，生长周期较长，因此通过组织培养来缩短育苗时长。在组织培养过程中存在种子萌发率低，愈伤组织诱导率低等问题，至今还未得到有效的解决。近年来，随着全球气温升高、气候变化大及降雨量的不均衡，致使柿属植物对于抗逆性砧木的需求增加，目前，抗逆砧木主要是通过实生繁殖，通过无性繁殖及分子育种途径获得抗逆砧木还在起步阶段，以君迁子种子为外植体的组培体系及叶片与茎段直接产生不定芽的研究尚未出现。君迁子组织培养中还存在诸多问题，比如：外植体褐化严重、无菌苗叶片生长弱、再生效率差及生根培养效果不佳等关键问题，严重限制了君迁子遗传转化的相关研究。本文通过研究不同消毒方法、基础培养基及植物生长调节剂等对君迁子组培苗生长的影响，成功建立了君迁子组织培养再生体系。

发明内容

本发明的首要目的是针对目前君迁子种子萌发率低，通过组织培养获得再生植株技术存在不足的问题，提供一种君迁子种子萌发的方法。君迁子组织培养方面的研究较少，与之前的相关研究对比分析，该方法萌发率高、生长效果好，明显缩短了君迁子种子的生长周期，愈伤组织及不定芽诱导率高，根系生长健壮，受材料限制小，为以后工厂化育苗及转基因技术提高可能性。

本发明的首要目的是通过以下方式实现的。

一种君迁子种子消毒的方法，包括以下步骤：

(1)种子的获得：以君迁子种子为外植体材料；

(2)外植体的处理:将种子外果肉去除干净，晾干后，在清水中浸泡洗净种子表面的一层白色薄膜；

(3)外植体的消毒：将君迁子种子用75％乙醇消毒4min后，用0.1％HgCl₂溶液中浸泡7-9min，优选8min，浸泡过程中要不时摇动，保证HgCl₂对种子的充分消毒，最后用无菌水冲洗3-5次。

本发明通过多次实验尝试，最终得到了效果显著的消毒方法，为以后的种子萌发、愈伤组织诱导等过程奠定了基础。

一种君迁子种子再生培养的方法，包括以下步骤：

(1)接种前预处理：将消毒后的君迁子种子置于45-55℃水浴锅处理2-6h，优选50℃处理4h；然后用1g/L GA₃浸泡13-16h，优选浸泡15h；

优选上述本发明消毒方法获得的种子作为外植体。

(2)初代培养：将消毒好的君迁子种子接种到1/2MS+0.8-1.2mg/L GA₃的培养基中光照条件下进行培养；