[发明专利]一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.1；将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D‑Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。本发明构建得到的基因改造酿酒酵母AoErg10D‑Y02319能够在以油酸为唯一碳源的培养基生长良好，且油酸利用率高，因此可将该因改造酿酒酵母AoErg10D‑Y02319用来降解油酸。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术

硫解酶普遍存在于原核生物和真核生物中。硫解酶在脂质代谢中发挥着重要作用，根据酶催化反应的方向可分为两类：3-酮脂酰基辅酶A硫解酶(ACAA；EC 2.3.1.16)和乙酰辅酶A乙酰基转移酶(ACAT；EC 2.3.1.9)。前者也称为硫解酶I，可以催化β-酮脂酰基辅酶A去除乙酰基产生乙酰辅酶A和少两个碳的酮酯酰辅酶A，该催化反应主要发生在脂肪酸β-氧化的每个循环的最后一步。后者又称为硫解酶II，可以催化两分子的乙酰辅酶A缩合产生乙酰乙酰辅酶A，该催化反应普遍存在于许多合成代谢过程的第一步，例如原核生物中甾醇和酮体的生物合成或聚(3-羟基丁酸)(许多细菌中的主要能量和碳储存分子)的合成。虽然这两种硫解酶催化可逆反应，但硫解酶I只参与催化分解代谢过程，这在热力学上是有利的，而硫解酶II通常催化合成代谢反应，且有时会参与分解代谢作用。

酿酒酵母，又称面包酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛，被认为是最具潜力的大规模生产菌种。

野生型酿酒酵母对油酸的利用率较少，在酿酒酵母中有一个3-酮酯酰辅酶A硫解酶(由ScPot1基因编码合成)，该酶催化脂肪酸β-氧化最后一步酮酯酰辅酶A分解产生乙酰辅酶A和少两个碳的酮酯酰辅酶A，根据研究发现，酿酒酵母缺失ScPot1蛋白的突变体表型表现为在以油酸为唯一碳源的培养基中无法生长，而野生型酵母可以利用油酸为唯一碳源进行生长。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用，旨在解决现有酿酒酵母对油酸的降解效率较低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其中，包括步骤：

获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.4；

将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；

将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D-Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。

所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其中，获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段的步骤包括：

根据所述AoErg10D基因的核苷酸序列设计对应引物序列，所述引物序列为SEQNO.13-14；