[发明专利]T6SS大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种T6SS大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用，具体为蛋白VI型分泌系统在异源大肠杆菌中的构建以及该大肠杆菌工程菌的生理功能特性鉴定，属于生物技术领域。本发明所述的T6SS基因簇是通过AeromonasdhakensisSSU全基因组数据而获得的，其基因簇全长约38kb，编码25个基因。本发明首次实现了T6SS在E.coliBL21(DE3)中的异源表达和组装，并对T6SS工程菌进行了一系列的表征和应用。该大肠杆菌工程菌具有较强的细菌杀伤能力以及蛋白分泌能力，将在细菌竞争以及免疫调节中具有广阔应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种T6SS大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用，特别是涉及一种新型VI型分泌系统大肠杆菌工程菌的构建及应用。

背景技术

蛋白VI型分泌系统(T6SS)是一种可收缩的管状分子装置，它能够将效应蛋白递送到邻近的真核细胞与原核细胞中，在种间竞争与生存过程中发挥重要作用。约有25％的革兰氏阴性菌编码了T6SS，其中包括许多重要的病原体：霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌以及肠聚集性大肠杆菌等。T6SS由跨膜复合体、基座复合体以及管状结构组成。Hcp内管的外部被VipA/B形成的外鞘所包裹，内管顶端为VgrG形成的三聚体以及锥形PAAR蛋白。外鞘收缩可引起Hcp-VgrG-PAAR复合体的外排，并伴随相关效应蛋白的分泌。收缩后的外鞘蛋白被ATP水解酶ClpV解聚成单体，并循环利用组装成新的T6SS。与保守的结构蛋白相比，依赖T6SS的效应蛋白在结构和功能上有很大差异，不同的效应蛋白使细菌能够有效对抗真核生物和原核生物。已知的效应蛋白具有引起肌动蛋白交联、细胞壁溶解、细胞膜破坏、核酸的降解等功能。除了这些天然毒素蛋白，T6SS还可以被工程分泌多种异源蛋白，如β-内酰胺酶、核酸酶、Cre重组酶等。

A.dhakensis是一种机会致病菌，可引起败血症和肠胃炎。A.dhakensis的模式菌株SSU编码了T6SS，具有抗真核和原核细胞的活性。它的基因组编码三种效应蛋白，一种成孔毒素TseC，一种自剪切的Rhs家族核酸酶TseI和一种溶菌酶TseP。每种效应蛋白都有其特有的免疫蛋白来实现自我保护。

Red/ET重组技术是对生物合成基因簇进行克隆和表达的有效工具。在表达Rac前噬菌体蛋白RecE、RecT、Redγ和RecA的宿主菌内，基因簇可被直接克隆到质粒载体中。但目前针对T6SS表达质粒构建的相关研究暂缺。本发明选择Red/ET重组技术对A.dhakensisSSU的T6SS进行克隆，并在异源宿主E.coli BL21(DE3)内进行装置的组装，进而开发T6SS大肠杆菌工程菌，将对未来T6SS机制研究、细菌竞争、药物递送和免疫调节等方面起到促进作用。

发明内容

基于以上技术问题，本发明提供了一种T6SS大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用，主要目的是构建一种异源表达T6SS的大肠杆菌工程菌。本发明首先提供了一段可异源组装、具正常功能的T6SS基因簇序列，该基因簇来源于A.dhakensis SSU基因组。通过挖掘、比对和可行性分析后，挑选出由hcp1(HMPREF1171_00923)到tsiP(HMPREF1171_00947下游基因)这一段作为假定的完整功能序列，其全长约为38kb，编码25个基因。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种T6SS表达质粒，所述T6SS表达质粒通过以下方法构建所得：

步骤A1、质粒载体的获取：设计含有来源于A.dhakensisSSU的基因组的T6SS基因簇同源臂的两组特异性引物，反向引物为两种，正向引物一种；以相同质粒为模板，分别使用上述两组引物进行载体扩增，得到载体；

步骤A2、RecET直接克隆T6SS基因簇：携带质粒的菌株表达RecET重组酶，电转线性T6SS基因簇和上述的质粒载体，进行克隆，构建出T6SS表达质粒。

作为本发明的一个实施方案，所述T6SS表达质粒的构建方法具体包括如下步骤：