[发明专利]一种生产2′-岩藻糖基乳糖的乳酸乳球菌及其应用

权利要求书

1.一种合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在乳酸乳球菌宿主的基因组上整合磷酸甘露糖异构酶编码基因manA、磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，同时通过质粒对甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶基因futC以及乳糖透过酶基因lacF进行表达。

2.如权利要求1所述的一种合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，其特征在于，将manA、manB、gmd和wcaG基因整合到宿主染色体的尿嘧啶磷酸核糖转移酶位点上进行表达；将manC、futC和lacF克隆到质粒pNZ8148上进行表达。

3.如权利要求1所述的一种合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，其特征在于，采用启动子P32对manA和manB基因进行表达；采用启动子Pnis对gmd和wcaG基因进行表达。

4.一种合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在乳酸乳球菌宿主中通过质粒对双功能岩藻糖激酶/1-磷酸岩藻糖鸟苷酸转移酶基因fkp、α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC以及乳糖透过酶基因lacF进行表达。

5.如权利要求4所述的一种合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，其特征在于，将fkp、futC和lacF克隆到质粒pNZ8148上进行表达。

6.如权利要求1或4所述的重组菌株，其特征在于，所述乳酸乳球菌宿主为乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000。

7.如权利要求1或4所述的重组菌株，其特征在于，所述启动子P32，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

所述启动子Pnis，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

所述fkp基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示

所述manA基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；

所述manB基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

所述gmd基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

所述wcaG基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；

所述upp基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；

所述futC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；

所述lacF基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；

所述manC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示。

8.权利要求1-7任意一项所述重组菌株在生产2′-FL中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵生产2′-FL时培养基中添加血红素。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵生产2′-FL的方法如下：

将重组菌种子液以1％-2％的接种量接种至含有相应底物的GM₁₇发酵培养基中，每30mL培养基中加入12μL 0.1mg/mL的Nisin溶液、30μL 50mg/mL氯霉素溶液、15μL 10mg/mL 5-氟尿嘧啶溶液，30℃、160r/min震荡培养36-52h；

GM₁₇发酵培养基组成为，以g/L计：磷酸氢二钠8.0-10.0，硫酸镁1.1-1.6，氯化钠4.0-5.0，无水乙酸钠1.0-1.5，酵母粉4.0-5.0，蛋白胨15.0-20.0，抗坏血酸0.3-0.5，MOPS35.0-45.0，10ml/L-20ml/L的微量元素溶液，葡萄糖15.0-20.0，乳糖5.0-10.0，其余为水；调节pH至7.0左右；

或者GM₁₇发酵培养基组成为，以g/L计：磷酸氢二钠8.0-10.0，硫酸镁1.1-1.6，氯化钠4.0-5.0，无水乙酸钠1.0-1.5，酵母粉4.0-5.0，蛋白胨15.0-20.0，抗坏血酸0.3-0.5，MOPS35.0-45.0，10ml/L-20ml/L的微量元素溶液，葡萄糖15.0-20.0，岩藻糖8.0-10.0，乳糖5.0-10.0，其余为水；调节pH至7.0左右；

所述微量元素溶液组成为，以g/L计：硫酸亚铁10.0，硫酸锌2.2，硫酸铜1.0，硫酸锰0.38，四硼酸钠0.02，七钼酸铵0.1，氯化钙2.0，其余为水。