[发明专利]ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用

说明书

本发明公开了ssc‑miR‑374b‑3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用。属于抗病毒药物技术领域。本发明将增加ssc‑miR‑374b‑3p表达的模拟物和降低ssc‑miR‑374b‑3p表达的抑制剂分别转染至猪小肠上皮细胞(IPEC‑J2)，转染后24h使用PDCoV感染细胞，感染病毒后12h以荧光定量PCR技术检测细胞中PDCoVM基因的表达量，发现PDCoVM基因的表达量分别显著减少和升高，表明ssc‑miR‑374b‑3p能够抑制PDCoV在IPEC‑J2细胞中的增殖。本发明为抗PDCoV增殖药物的制备提供了新的候选miRNA。

技术领域

本发明涉及抗病毒药物技术领域，更具体的说是涉及ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种猪肠道致病性腹泻病原，可诱发猪出现水样腹泻、呕吐、脱水和死亡。该病毒已成为诱发猪腹泻病的主要病原体之一，对养猪业造成了巨大的经济损失。目前尚无商业化疫苗和特异性药物用于防治该病毒引发的猪腹泻病，迫切需要发展新的抗病毒策略。

目前研究者正在从研制抗病毒药物和疫苗靶标两个角度积极寻找抑制PDCoV复制的抗病毒分子。

从研发抗病毒药物角度探索的抗病毒分子多为化合物。罗丹宁衍生物LJ001对PDCoV在ST细胞中的复制具有有效的抑制能力，其能够限制病毒RNA和蛋白质的合成，并抑制该病毒的复制。胆固醇的氧化产物25-羟基胆固醇能够通过阻断PDCoV进入细胞进而抑制该病毒复制。胆汁酸鹅去氧胆酸和石胆酸通过诱导IFN-λ3和IFN刺激基因15(ISG15)的产生抑制PDCoV复制。麦角甾醇过氧化物(EP)在病毒附着、病毒入侵阶段对PDCoV的复制均具有抑制活性。此外，褪黑素、热休克蛋白90抑制剂17-AAG和VER-82576，均在PDCoV复制的早期阶段抑制该病毒的复制，凝集素GRFT能够与PDCoV表面的刺突蛋白结合，通过包裹病毒并阻止其进入细胞抑制该病毒复制，而消化道皮肤素D(GSDMD)通过促进IFN-β的非常规分泌抑制PDCoV复制。

从研发疫苗角度寻找抗病毒分子的报道集中于构建表达病毒基因的shRNA质粒、来自病毒基因组的减毒活病毒疫苗候选基因和病毒样颗粒(VLP)。基于PDCoV基因组M和N基因构建的shRNA能够抑制PDCoV在ST细胞中的复制，研究人员进而设计了一种针对N基因的双shRNA表达质粒，命名为pSil-double-shRNA-N1。NS6蛋白是PDCoV的一个重要毒力因子，为开发减毒活疫苗提供了潜在的候选基因。Zhang等人用绿色荧光蛋白(GFP)替换PDCoV全长感染性cDNA克隆的NS6基因，以生成重组病毒rPDCoV-ΔNS6-GFP。rPDCoV-ΔNS6-GFP在体外和体内均表现出病毒产量下降，并且rPDCoV-ΔNS6-GFP感染仔猪后几乎未观察到临床症状或肠道病变。含Qβ噬菌体外壳蛋白的VLP嵌合疫苗具有冠状病毒的抗原表位，该疫苗可以诱导小鼠体内产生对MHV、PEDV和PDCoV的中和抗体反应。

综上所述，有待从新的角度进一步探索抑制PDCoV复制的抗病毒分子及相关机制，以丰富用于该病毒疫苗和特异性药物研发的靶标分子种类。

microRNA(miRNA/miR)是非编码RNA家族的成员，其在转录后水平调控功能基因的表达，广泛参与多种生物学过程的调控。研究发现，miRNA能够通过调控宿主细胞天然免疫应答、细胞凋亡、线粒体损伤等途径实现对多种冠状病毒增殖的抑制作用，但抑制PDCoV增殖的抗病毒miRNA尚不明确。本发明另辟蹊径，从miRNA角度为PDCoV的抑制药物提供候选抗病毒分子。

申请人发现，猪miR-374b-3p(ssc-miR-374b-3p)能够调节PDCoV在猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell line J2，IPEC-J2)中的增殖，本发明从新的角度为抗PDCoV增殖药物的制备提供了候选miRNA。

发明内容