[发明专利]一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用，采用遗传密码扩增方法制备了AKR‑pAzF突变体和ADH‑p‑PaF突变体，然后在细胞裂解液中一步反应交联得到位点可控和有序交联的双酶聚集体；并且通过蛋白标记，使双酶的有序方式得到验证。本发明有序交联双酶与无序交联方式相比，有较高的底物亲和力和酶活性；有序交联双酶有较好催化性能，在用于手性醇药物中间体的催化合成中，有远优于无序交联酶的催化率和稳定性；其次酶蛋白之间的有序共价连接和连接位点的灵活性使得双酶之间的距离又变成了一个可控因素，酶靠近引起的底物通道效应可明显提高级联反应中酶的催化效率，使得酶蛋白有序交联的研究变得更加有意义。

技术领域

本发明涉及一种有序交联双酶聚集体的制备方法，具体的说是涉及一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用。

背景技术

开发更清洁、更高效的化学工艺一直是化学研究的主要目标之一。有机化学合成在此方面进行了复杂的探索，但仍然有很大的改进空间，尤其是在“绿色化学”方面。用催化程序代替化学计量、在有机合成中使用酶或微生物以及在一锅中组合几个反应而不分离中间体(级联反应)被认为是建立环境友好和可持续化学过程的重要策略。在多酶级联系统中集成多种生物催化转化特别有吸引力，因为生物催化剂本质上是“绿色的、可持续的”(可生物降解的)、高度选择性的，而且最重要的是，它们在某些操作条件范围内相互兼容。事实上，活的有机体在常见的胞质溶胶中进行各种各样的酶促反应，并且保持酶催化过程的有序性和完整性。与体内催化过程相比，体外工程的灵活性可以避免细胞活力的复杂性、生理学以及细胞膜或细胞壁带来的问题。

然而，用于体外多酶反应的经典方法是在不同的阶段进行的。这种方法有几个缺点，例如产量低、操作成本高以及在分离步骤中使用许多化学品。为了解决这些问题，需要一种新的策略来提供诸如对映选择性、立体选择性、高产率、低成本、反应平衡转移以及实现多步骤而无需产物回收等优点。在自然界中，许多生化反应是由多酶级联系统(MECS)催化的，MECS由高度有序的酶组装而成。MECS可以高效地完成催化，中间体在酶的不同活性位点之间运输，消除反应中间体的繁琐分离和纯化。从自然界中的这些MECS中汲取灵感，研究人员致力于通过精确的设计在体外重建这些MECS。在多酶共固定化中，由于级联反应的有序性，需要通过选择合适的固定化策略来准确控制酶的定位和定向。

通过随机共固定的多酶固定可能是提高整体催化活性和稳定性的最简单策略。然而，为了控制固定模式，固定化酶的比例或表面酶附着的官能团分布可能会带来挑战。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用；本发明从细胞裂解液中直接进行共价交联形成交联多酶，实现酶蛋白的有序交联；本发明可以提高催化活性和稳定性，并实现自我纯化。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH作为模型酶蛋白，通过两种非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸(p-Azido-L-phenylalanine,pAzF)和对炔丙氧基-L-苯丙氨酸分子修饰(p-propargyloxy-L-phenylalanine,p-PaF)，得到的双酶突变体，即AKR-对叠氮基-L-苯丙氨酸(AKR-pAzF)突变体和ADH-对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(ADH-p-PaF)突变体；然后，细胞裂解后，混合双酶上清液，在微波辐射辅助下，在细胞裂解上清混合液中直接进行共价交联，完成定点有序交联，得到双酶聚集体(有序交联双酶)。