[发明专利]一种多糖及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用

说明书

本发明公开了一种多糖及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用。本发明从血耳中分离得到一种分子量不同于现有技术中TSP‑II多糖的均一多糖TSP‑X，活性研究发现该多糖具有促进NK细胞增殖的作用，且不会降低NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。因此，本发明提供的血耳均一多糖TSP‑X可以用于扩增NK细胞进而用于细胞免疫治疗。

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗领域，尤其涉及一种多糖及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是机体抵抗病原微生物感染及清理自身癌变细胞的重要固有免疫细胞。NK细胞的功能受抑制型受体和活化型受体介导的信号强度之间的平衡来调节，活化后的NK细胞可直接杀伤靶细胞，也可以分泌细胞因子和炎性因子参与免疫调节。近年来，基于NK细胞免疫功能的抗肿瘤免疫疗法成为肿瘤治疗的新兴热门领域。

将NK细胞用于免疫细胞治疗首先要解决的问题就是如何获得大量NK细胞进而输入人体。因此，对NK细胞增殖能力提高的研究一直没有松懈。

多糖的一级结构由单糖通过糖苷键连接而成，一级结构再通过范德华力等作用力形成高级结构，多变的一级结构和高级结构决定了不同多糖可以形成不同的结构域，这些不同的结构域让不同多糖产生了不同的、丰度的生物活性。

多糖在免疫领域也早有应用，开发更多活性多糖也是细胞免疫领域研究的重要方向。

银耳属真菌作为重要的食用真菌之一，在中国境内广泛存在。常见银耳属的可食用真菌主要有银耳、脑耳、金耳和血耳。银耳属多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤，免疫调节，降血糖，抗氧化，降血脂和抗血栓等，银耳属多糖因此受到广泛关注。血耳(Tremellasanguinea Peng)隶属银耳科(Treimellaceae)、银耳属(Tremella)，相较于银耳属其它多糖，目前国内外有关血耳多糖的研究报道较少。王昭晶等从血耳中分离得到一种均一多糖TSP-II，并发现该多糖具有抗炎活性(血耳多糖的提取工艺、微观结构及其抗炎症作用，中国食品学报，2019年1月)。最新研究表明，血耳总多糖可以显著促进小鼠巨噬细胞的增殖(血耳多糖对小鼠Raw264.7巨噬细胞的免疫调节作用研究，农产品加工，2022年4月)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多糖及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种多糖，通过如下步骤制备：

取适量血耳，加入蒸馏水，沸水浴提取，过滤收集滤液，减压浓缩、冷却、离心，离心条件为3500r/min离心10min；取上清液，加入4倍体积无水乙醇沉淀、离心，离心条件为3500r/min离心10min；收集沉淀得血耳总多糖，Sevag法脱蛋白；

取脱蛋白的血耳总多糖，用蒸馏水配制成质量分数为5％的糖液，缓慢加入硫酸铵，使得硫酸铵的浓度达到30mg/mL，静置12h，5000r/min离心20min，收集滤液；滤液继续缓慢加入硫酸铵，使得硫酸铵的浓度达到50mg/mL，静置12h，5000r/min离心20min，收集沉淀；蒸馏水复溶，用截留分子量3500u的透析袋透析，冷冻干燥得分级多糖；

取分级多糖，用蒸馏水配制成20mg/mL的糖液，3500r/min离心10min，取20mL上清液上样于内径2.5cm、柱床高度30cm的Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析柱，蒸馏水洗脱，流速为2mL/min，10mL收集1管并从1开始按顺序编号，每管取少量进行苯酚-硫酸显色测定OD490nm吸光度值，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线主峰对应编号12～20的收集管中的洗脱液，合并，冷冻干燥即得。