[发明专利]一株高效生产克拉酸的脂多糖结构截短的大肠杆菌菌株的构建

说明书

本发明公开了一株高效生产克拉酸的脂多糖结构截短的大肠杆菌菌株的构建，属于基因工程和发酵工程领域。本发明通过在脂多糖截短的大肠杆菌WQM001菌株基础之上继续删除ackA，rfbB，rfbD，rfbA，rfbC，rfbX，glf，wbbH，wbbI，wbbJ，wbbK以及wbbL基因构建得到WZM008菌株。随后通过构建pTrcS质粒过表达uppS基因，并将该质粒导入WZM008成功构建WZM008/pTrcS重组菌株。WZM008/pTrcS重组菌上罐水平达到11.68g·Lsupgt;‑1/supgt;，是出发菌株克拉酸产量的3.54倍。且根据本发明制备得到的克拉酸，分子量可达11.4×10supgt;3/supgt;kDa，具备三螺旋结构。本发明首次探究了代谢途径改造对克拉酸生产的影响，为后续代谢工程改造大肠杆菌构建克拉酸高产菌株提供了新思路，同时对克拉酸的工业化生产起到了一定的促进作用。

技术领域

本发明涉及一株高效生产克拉酸的脂多糖结构截短的大肠杆菌菌株的构建，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

近年来，细菌多糖在化妆品行业、食品领域以及生物医药领域应用前景广阔。克拉酸(colanic acid,CA)是一种细菌在胁迫环境下产生的具有保护性作用的胞外多糖，广泛存在于肠杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属以及产气杆菌属中。克拉酸作为一种活性生物大分子多糖，具有优良的生物学特性及理化性质，可被应用于诸多领域。例如克拉酸的疏松多孔结构及大量暴露于表面的亲水基团，使得克拉酸具备优异的持水性能，在食品行业、化妆品行业以及医疗行业具有极大的应用潜力；克拉酸单糖组分中岩藻糖含量较高(30％左右)，这表明克拉酸可能具备抗癌、抗肿瘤以及抗炎症等生物活性；除以上外，克拉酸及克拉酸单体还被证明具有通过调节宿主细胞的线粒体动力学从而延缓衰老以及延长宿主寿命的功能。综上，克拉酸应用前景广阔，具备较高的生产价值。

在Escherichia coli str.K-12 MG1655菌株中，克拉酸的合成严格受到Rcs磷酸级联系统的负调控。当细胞面临环境胁迫或者包膜应激时，Rcs系统响应环境信号磷酸化RcsB，磷酸化的RcsB与辅助蛋白RcsA结合形成异质二聚体，激活克拉酸合成基因簇cps(图1A)。其中辅助蛋白RcsA受到ATP依赖性蛋白酶Lon负调控，在高温时可被Lon降解。

克拉酸合成主要包括三个阶段：核苷酸糖前体合成阶段、克拉酸单体的合成及聚合阶段以及转运阶段(见图1B)。克拉酸单体是由D-半乳糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖及D-葡萄糖醛酸以摩尔比2：2：1：1构成的六糖单元，辅之以非化学计量的乙酰基化以及丙酮基修饰形成。克拉酸单体的合成需要四种核苷酸糖前体，即二磷酸鸟苷岩藻糖(GDP-L-Fuc)，二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-D-Glc)，二磷酸尿苷半乳糖(UDP-D-Gal)和二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDP-D-GlcA)四种核苷酸糖，其中UDP-D-Glc和UDP-D-Gal可流向LPS合成途径及O-抗原合成途径。在四种核苷酸糖的供应下，葡萄糖基转移酶WcaJ将UDP-D-Glc中的1-磷酸葡萄糖基团转移至脂质载体十一烯基磷酸酯(Undecaprenyl phosphate,Und-P)，将六糖重复单元的生物合成过程锚定在细胞内膜的内叶上形成Und-PP-Glc，启动克拉酸的合成。Und-PP-Glc在经由WcaI、WcaF、WcaE、WcaC、WcaB、WcaA、WcaL和WcaK的逐步催化后，形成克拉酸重复单元。克拉酸经WcaD聚合后，经由Wza-Wzb-Wzc转运至胞外。

目前关于微生物发酵法生产克拉酸的报导相对较少，已发表的微生物发酵法生产克拉酸相关研究均以大肠杆菌作为生产菌株，且主要集中于解除Rcs系统对cps基因簇的负调控以及维持低pH条件等，目前关于代谢途径改造以高产克拉酸相关研究较少。克拉酸应用前景广阔，因此通过系统代谢工程改造构建高效生产克拉酸的大肠杆菌菌株对于后续克拉酸的大规模工业化生产尤为必要，特别是能提供一种无需在发酵制备克拉酸的过程中额外添加碱性物质以维持pH的方法，对工业生产有重大的意义。

发明内容