[发明专利]银杏多态性EST-SSR分子标记引物及其应用

说明书

本发明公开了银杏多态性EST‑SSR分子标记引物及其应用，属于分子标记开发技术及其应用领域。本发明从银杏转录组数据中筛选出了EST‑SSR位点，并设计合成了100对引物，以全国141份银杏种质基因组DNA为模板通过有效性验证和多态性筛选，最终获得了20对稳定性好、多态性高的特异性EST‑SSR分子标记引物。本发明还进一步公开了上述自主开发的分子标记引物在银杏遗传多样性分析及核心种质构建等方面的应用。本发明提供的EST‑SSR分子标记引物为银杏遗传进化分析、亲缘关系鉴定和良种选育等研究提供理论与技术支撑，对于银杏种质资源的合理利用、保存与保护具有重要价值。

技术领域

本发明属于EST-SSR分子标记开发及其应用领域，具体涉及银杏转录组多态性EST-SSR特异性分子标记引物，进一步涉及所述分子标记引物在银杏遗传多样性分析及核心种质构建等方面的应用。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是世界上现存最古老的孑遗裸子植物之一，有“活化石”之称。银杏作为我国特有乡土树种，不仅蕴含着丰富的遗传资源，还是重要的经济树种，具备观赏用、药用、食用和材用等多应用价值，对银杏开发利用具有广阔的前景。目前我国银杏资源数量约占世界总量的90％，在我国20多个省区都有分布。其中淮河以南的长江中下游地区及南岭山地的广大地区，包括江苏、广西、湖南、山东、浙江、湖北等地的银杏栽培历史最悠久，形成了丰富的种质资源。以上地区是银杏的适生栽培区，也是全国种核和干叶生产的主要基地。银杏虽分布广泛，数量庞大，但多为人工栽种，自然野生群体罕见，且为银杏科(Ginkgoaceae)、银杏属(Ginkgo)的单种植物，导致了其遗传多样性的匮乏，已被列为I级濒危物种。

遗传多样性是生物多样性的基础和核心，决定了植物适应环境和维持生态系统稳定的能力。了解遗传多样性变化规律及影响因素，对合理利用与保护植物资源具有重要意义。其中影响植物遗传多样性的因素主要包括繁殖系统、自然选择、遗传漂变、基因突变、基因流、环境变化和人为干扰等。因此，研究植物遗传多样性不仅可以了解群体遗传变异水平和遗传结构的稳定性，还可以更加有针对性地建立保护措施，为提高群体遗传多样性水平提供高效策略。分子标记作为DNA水平变异的表现，是目前研究植物遗传多样性的常用方法。其中SSR(Simple Sequence Repeat)即简单重复序列，作为一种可遗传的共显性分子标记，具有数量多，开发简单，多态性高和稳定性好的优点，被广泛应用于植物遗传多样性分析、核心种质构建和亲缘关系鉴定等研究中。SSR可分为表达序列标签(EST-SSR)和基因组SSR(g-SSR)两种，其中EST-SSR主要来源于转录组等数据，其多态性可能与基因表达功能直接相关，具有更高的通用性和转化率。且随着基因测序技术的发展与测序成本的降低，也为利用转录组数据开发EST-SSR分子标记提供了便利。分子标记数量的不足是阻碍银杏遗传多样性研究的重要因素，因此，有必要开发足量、稳定、高效的SSR分子标记。

核心种质是指通过保留种质资源中部分材料来代表原始种质的遗传多样性，这部分保留种质必须满足最小资源数量和最大的遗传重复两个条件。近年来随着遗传资源数量的增加，给银杏种质资源的保存与利用带来了困难。而核心种质对于解决因银杏资源数量繁多引起的种质保存问题提供了途径，也为合理保护与有效利用银杏遗传资源提供了策略。目前针对银杏核心种质的构建，主要为ISSR、AFLP等显性标记数据，暂未见利用SSR分子标记数据构建银杏核心种质的研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明需要解决的技术问题之一在于开发银杏多态性EST-SSR分子标记引物，另一所需解决的技术问题在于将多态性EST-SSR分子标记引物应用于银杏种质资源遗传多样性分析及核心种质构建中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

银杏转录组EST-SSR分子标记引物的开发，包括以下步骤：

(1)基因组DNA的提取；