[发明专利]用非稀有细胞检测稀有细胞的方法

说明书

本发明涉及用非稀有细胞检测稀有细胞的方法。本发明提供了开创性的计算方法，其利用非稀有细胞数据来检测稀有细胞，如循环肿瘤细胞(CTC)。本发明可用于CTC检测的两个不同阶段；第一是作出关于数据收集参数的决定，第二是在数据缩减和分析中作出决定。此外，本发明在作出决定的过程中利用一维和多维参数化的数据。

本申请是分案申请，基于申请号为201710186990.6的分案申请。原申请的申请日为2010年10月20日，中国申请号为201080057853.9，发明名称为“用非稀有细胞检测稀有细胞的方法”。

技术领域

本发明总体涉及医学诊断，更具体地涉及稀有细胞如循环肿瘤细胞(CTC)的检测和分类。

背景技术

未被满足的重要医疗需要存在于在细胞水平上对上皮癌症患者的纵向疾病监测。预测和监测治疗反应和疾病进程鉴于自然病程和对治疗压力反应的选择性选择过程对上皮癌症患者尤为重要。虽然在对第一和转移性肿瘤在其各自微环境中的了解中已有所进展，但在对流体相期间癌症行为的了解中存在重大障碍，因为其遍布于血流中并占据血流。癌症的循环组分其中包含引起未来转移的细胞，因此代表引人注目的研究目标。

充分表征此固体肿瘤流体相的临床意义的研究已由于缺少容易获得的和可靠的鉴定CTC的实验工具而被阻碍。血液中CTC未知的特征和低且未知的频率加上难以区别癌症上皮细胞与正常上皮细胞，已严重阻碍流体相如何可能具有临床重要性的研究。理想的流体相活组织检查应在大多数上皮癌症患者体内发现大量特定CTC群，并保留和向病理医师和/或研究人员呈现不仅能计数而且能进行进一步分子、形态和/或表型分析的形式的CTC。此外，其应保留其余稀有群，用于进一步分析。

CTC一般——虽然并非一定——是以极低的浓度源自固体肿瘤并进入不同类型癌症患者的血流的上皮细胞。CTC也被认为能够起源于血液中，在整个身体中形成小群落。已存在的肿瘤或转移生成的CTC的脱落通常导致第二肿瘤形成。第二肿瘤一般检测不到，并导致全部癌症死亡中的90％。循环肿瘤细胞提供第一与转移性肿瘤之间的关联。其导致这样的前景：将循环肿瘤细胞的鉴定和表征用于转移性上皮恶性肿瘤的早期检测和治疗处理。癌症患者的CTC检测提供在早期诊断第一或第二癌症生长和确定进行癌症治疗的癌症患者的预后中有效的工具，这是因为这种患者血液中存在的CTC的数量和表征已被关联于全部预后和对治疗的反应。因此，CTC充当临床症状出现前肿瘤扩张或转移的早期指示剂。

虽然CTC的检测在癌症的处理和治疗中具有重要的预后性和潜在的治疗性意义，但由于其在血流中隐匿的性质，这些稀有细胞不易被检测到。1800年代首次描述了CTC，但是仅近期技术进步允许其可靠的检测。循环肿瘤细胞检测中的挑战是其相对于其他有核细胞以相对低的频率存在，通常低于1:100,000。为弥补该挑战，检测循环肿瘤细胞的大多数常规方法依赖于实验富集方法，由此使CTC优先地与其他细胞组分(例如，非CTC)——最重要的是最近似于CTC的其他有核细胞——分离。

目前，对于计数/表征CTC应用最多的阳性富集方法是靶向表面蛋白EpCAM和“CTC芯片”的免疫磁性富集方法。最广泛用于检测CTC的方法，JJ’s Veridex技术，利用免疫磁性富集。该技术依赖于肿瘤细胞群的免疫磁性富集，利用连接于结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体的铁磁流体，该上皮细胞粘附分子仅在上皮衍生细胞上表达。该方法需要7.5mL血液用于分析，并仅在一些转移性癌症患者中发现2个以上CTC。

微流体或“CTC-芯片”技术，是另一种用于计数/表征CTC的阳性富集方法。该方法采用1-3mL血液，其中全血流经78,000个EpCAM涂布的微柱(microposts)。EpCAM+细胞粘附于该柱，并随后用细胞角蛋白CD45和DAPI染色。以该方法，CTC以相对高的纯度被发现于几乎所有的转移性癌症患者中，而未被发现于健康对照中。此外，CTC-芯片技术鉴定出所有患者中的CTC，并且数量上比两个近期出版物所报道的其他技术高约10至100倍的因数。