[发明专利]一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用

说明书

本发明公开了一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用。本发明公开的使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法，包括将设计改造的SKP1‑Cullin1‑RBX1融合蛋白质(简称为eSCR)与F‑box蛋白质在反应体系中进行反应，得到E3连接酶；eSCR融合蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10‑1062位。实验证明，本发明在体外成功利用eSCR融合蛋白质重组了不同的多亚基SCF E3连接酶，且所得E3连接酶具有生物学活性，本发明在解析多亚基SCF E3连接酶分子作用机理的广泛潜在的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用。

背景技术

蛋白质降解对于维持细胞及机体正常功能具有重要作用。在真核细胞中，蛋白降解的两个主要方式是溶酶体降解途径和泛素-蛋白酶体降解途径。其中，泛素-蛋白酶体降解途径是由底物蛋白的泛素化修饰和蛋白酶体降解两个过程组成，参与调控生命过程中的重要环节，包括细胞增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录、信号转导和蛋白质质量控制等过程。在植物中，许多控制重要细胞生物学过程的蛋白均被泛素-蛋白酶体途径调控，如生长素信号途径中的关键因子TIR1、茉莉酸信号途径的关键因子COI1、赤霉素信号途径中的关键因子GID2以及独脚金内酯信号途径中的关键因子D14和D53等。目标蛋白的泛素化修饰需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3依次协同作用。其中，SCFE3连接酶是一类多亚基RING E3连接酶，其成分包括SKP1蛋白、Cullin1蛋白、RBX1蛋白和一个可变F-box蛋白。在高等植物中，多亚基SCF E3连接酶在调控植物的生长发育和胁迫应答中发挥至关重要的作用。

体外泛素化修饰分析体系对于研究E3连接酶或者底物蛋白在植物生长发育过程中的分子作用机理具有重要的作用。目前为止，在植物中关于体外重组多亚基E3连接酶活性的研究仍旧空白，这极大地阻碍了研究多亚基E3连接酶分子作用机理的进程。为了解析多亚基SCF E3连接酶的作用机理，有必要建立并优化多亚基SCF E3连接酶体外活性重组体系。建立多亚基SCF E3连接酶体外活性重组体系最大的困难之一，是获取多个有活性的、SCF亚基组成成分。探究利用设计改造的SKP1-Cullin1-RBX1融合蛋白(简称为eSCR)建立多亚基SCF E3连接酶体外活性重组平台，将具有重要的生物学意义，同时对于推进植物多亚基E3连接酶分子作用机理的研究具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何体外制备多亚基SCF E3连接酶。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种多亚基SCF E3连接酶的制备方法，所述方法包括：将eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质在反应体系中进行反应，得到有活性的多亚基SCF E3连接酶；

所述eSCR融合蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10-1062位的融合蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2的第10-1062位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.2的第10-184位是SKP1蛋白的氨基酸序列，第189-932位是Cullin1蛋白的氨基酸序列，第937-1062位是RBX1蛋白的氨基酸序列，第185-188位和第933-936位分别是连接SKP1蛋白与Cullin1蛋白和连接Cullin1蛋白与RBX1蛋白的多肽linker序列。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.2的第10-1062位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列