[发明专利]miRNA-SSR分子标记引物在葡萄耐热性鉴定方面的应用

说明书

本发明公开了葡萄miRNA‑SSR分子标记引物在葡萄耐热性鉴定方面的应用，葡萄miRNA‑SSR分子标记引物选自以下引物形成的组：VMIRSSR156c1、VMIRSSR157c2、VMIRSSR159f2、VMIRSSR160c1、VMIRSSR164b1、VMIRSSR167c3、VMIRSSR169d1、VMIRSSR171b1、VMIRSSR171k1、VMIRSSR398b1、VMIRSSR398c3、VMIRSSR167d1和VMIRSSR828a1。本发明基于miRNA‑SSR的筛选方法为葡萄品种耐热性鉴定以及分子标记辅助育种提供重要依据，丰富分子标记鉴定类型，提高鉴定效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及葡萄miRNA-SSR分子标记引物在葡萄耐热性鉴定方面的应用。

背景技术

葡萄(Vitis vinifera spp.)是葡萄科葡萄属落叶藤本植物，具有悠久的栽培历史，葡萄产业已经成为我国果树产业的重要组成部分之一，然而葡萄产业在迅速发展的同时也面临着严峻挑战。近年来，随着温室效应的加剧，全球气温在不断升高。根据政府间气候变化委员会(IPCC)第五次评估报告数据显示，到未来2100年，全球气温甚至会增加1-3℃，加上我国主栽的葡萄品种为欧亚种和欧美杂交种葡萄，对高温胁迫的耐受性差。高温会导致葡萄叶片卷曲失水干枯，光合效率降低，果实品质较差，进而影响生理生化反应及逆境诱导基因的表达和调控，严重损害自身逆境调控的能力，造成热害甚至萎蔫死亡，很大程度上制约葡萄产业的发展。我国研究人员很早就注意到葡萄的耐高温问题，并开展针对性的研究。但随着欧亚种葡萄等栽培面积的增多，生产中出现的热害问题也日益增加，主要表现为叶片、枝条生长发育不良、果实品质下降等问题。目前对抵抗高温的葡萄优质资源知之甚少，分子标记的开发也比较单一，导致育种效率低下。因此，对分子标记的开发及耐热品种的鉴定选育成为葡萄抗逆育种的重要方向。

目前，分子标记已广泛应用与种质资源研究、遗传图谱构建、遗传多样性分析、亲缘关系研究及目的基因定位以及辅助标记选择育种。微卫星(micro satellite)是由2-6个核苷酸串联重复片段形成的分布均匀在基因组中的简单重复序列(SSR)，具有多态性高、稳定性强、操作简单、多等位基因、数量丰富和基因组覆盖性好等优点，已成为品种鉴定的主要技术。通过分析该物种参考基因组中存在的SSR，进一步采用聚合酶链式反应(PCR)结合琼脂糖凝胶电泳，聚丙乙烯凝胶电泳等检测分析，最后结合生物学统计分析得到该分子标记检测的多态性等位基因数值。国外已将VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD25、VVMD27、VVMD28、VVMD32、VrZAG79、VrZAG62等9对SSR引物作为葡萄品种鉴定的国际通用标记。miRNA作为重要的基因表达调控因子在植物的生长发育和逆境胁迫中都起到非常关键的作用，已有研究证明多个miRNA在葡萄的生长发育过程发挥重要作用，如miR164b和miR828；以及发现miR171d的初级转录本pri-miR171d编码的多肽Vvi-miPEP171d1可以促进葡萄组培苗不定根的形成。但关于葡萄中pri-miRNA核苷酸序列中存在的SSR分子标记未见报道。以往研究中SSR多态性的验证多采用各种电泳-跑胶结果的生物学统计，这种方法比较耗时耗力，对实验室的污染也比较严重。另外，胶图中条带的差异可能不是SSR重复类型不同而影响的差异，很大可能是由于部分序列的缺失造成，很大程度地说明实验数据和分析结果不准确。因此，葡萄参考基因组数据开发miRNA-SSR分子标记对葡萄抗热性品种的鉴定以及分子标记辅助育种提供重要证据。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种葡萄miRNA-SSR分子标记引物。

本发明的目的之二在于提供上述葡萄miRNA-SSR分子标记引物在葡萄品种耐热性鉴定中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种鉴定葡萄耐热性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：