[发明专利]一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法

权利要求书

1.一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：通过第53位、第54位定点突变技术改造VHb的基因，提升其催化性能；

步骤2：通过E.coli RP523菌株生物表达的方法，将VHb中原始血红素辅基替换为其他金属卟啉，进一步提升催化活力；

步骤3：将构建的卟啉替换VHb人工金属酶-尿素酶催化系统应用于催化级联反应合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物。

2.根据权利要求1所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于：在步骤1中，所述第53位及第54位定点突变以构建在PUC19质粒上的VHb基因为模板，原始VHb序列如SEQ ID NO.1所示，设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第53位谷氨酰胺突变为组氨酸，得到第53位单突变体，命名为VHb-Q53H；设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第54位脯氨酸突变为半胱氨酸，得到第54位单突变体，命名为VHb-P54C；设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第53位谷氨酰胺突变为组氨酸，第54位脯氨酸突变为半胱氨酸，得到双突变体，命名为VHb-Q53H/P54C。

3.根据权利要求1或2所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于：表达载体含权利要求1-2所述任意一项突变体。

4.根据权利要求3所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于：基因工程菌含有权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求1所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于：E.coli RP523菌株是一种卟啉合成缺陷型菌株，对外源卟啉有较好的通透性，通过基因工程菌的构建，能够表达权利要求3所述的表达载体；通过添加外源金属卟啉Co(ppIX)和Mn(ppIX)，对应表达出几种含有Co(ppIX)和Mn(ppIX)辅基的VHb人工金属酶，命名为Co-VHb-WT，Co-VHb-Q53H，Co-VHb-P54C，Co-VHb-Q53H/P54C，Mn-VHb-WT，Mn-VHb-Q53H，Mn-VHb-P54C，Mn-VHb-Q53H/P54C。

6.根据权利要求2所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，步骤3中的催化级联反应合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物的方程式如下所示：

其中，R1，R2表示叔丁基；R3表示正丙基，异丙基，环己基，乙基，呋喃基，吡啶基，苯基，4-甲基苯基，4-甲氧基苯基，4-氯苯基，4-溴苯基，4-氰基苯基，3-甲基苯基，2-甲基苯基，2-氟苯基。

7.根据权利要求5所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，反应的底物为邻苯二酚类化合物、醛类化合物以及尿素的混合物，其中，所述底物的浓度范围为0.1mmol-1mmol；邻苯二酚类化合物、醛类化合物、尿素的摩尔比为1：1：0.5～1：1：1，最优选为1：1：0.6。

8.根据权利要求5所述的双酶系统催化2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，反应体系中尿素酶的加入量为200-400U，最优选为300U。所述人工金属酶加入量为0.01-0.1mol％，最佳用量为0.05mol％。所述双酶与底物一同加入至加有10％的促溶剂的水中，暴露于空气或氧气在下在25℃-50℃反应2h-24h。

9.根据权利要求7所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，反应的溶剂最优为加有10％二甲基亚砜作为促溶剂的水溶液。

10.根据权利要求7所述的一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法，其特征在于，最佳的反应时间为12小时，最优的氧化剂为氧气。