[发明专利]SA-MBD重组蛋白以及表达方法和应用

权利要求书

1.SA-MBD重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示。

2.编码SA-MBD重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO ：2 所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组工程菌。

5.一种SA-MBD重组蛋白的表达方法，其特征在于，人工合成编码SA-MBD的DNA，克隆至原核表达载体pET-30a(+)，转化大肠肝菌BL21（DE3），以IPTG在37℃诱导表达，通过镍柱亲和纯化，以获得和甲基化DNA高亲和力的SA-MBD重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的SA-MBD重组蛋白的表达方法，其特征在于，主要步骤如下：

（1）人工合成目的蛋白SA-MBD的编码基因；

（2）将步骤（1）中合成的SA-MBD蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，以获得重组表达载体；

（3）用步骤（2）中所得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌；

（4）用步骤（3）中的重组基因工程菌作为生产菌株，加入IPTG，37℃诱导表达8h；

（5）用步骤（4）中的菌体超声，离心，上清上样于镍柱，亲和纯化目的蛋白，并通过重力脱盐柱将咪唑等小分子物质除去。

7.根据权利要求6所述的SA-MBD重组蛋白的表达方法，其特征在于，表达载体为pET30a(+)。

8.根据权利要求6所述的SA-MBD重组蛋白的表达方法，其特征在于，

所述SA序列包括160个氨基酸，序列SEQ ID NO：3所示；

所述MBD序列包括112个氨基酸，序列SEQ ID NO：4所示；

所述接头序列包括20个氨基酸，序列如SEQ ID NO：5所示；

所述分离纯化标签序列标签包含6个组氨酸，序列如SEQ ID NO：6所示。

9.权利要求1所述的重组蛋白，和/或，权利要求2或3所述的基因，和/或，含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组工程菌在原位检测甲基化DNA中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下具体步骤：

（1）先培养A549细胞15 h；

（2）PBS溶液清洗细胞两次；

（3）用2 mL胰蛋白酶消化细胞10 min，1000 rpm离心5 min，1mL 1% Triton X-100 的75 mM KCl溶液重悬A549细胞；

（4）取200 μL重悬液平铺于载玻片上，风干；

（5）取20 μL浓度为1 μM的SA-MBD重组蛋白于载玻片上，孵育3 h；

（6）PBS冲洗1 min后，取20 μL 1.5 μM的Biotin-FITC于载玻片上，孵育2 h；

（7）PBS冲洗1 min后，取20 μL DAPI溶液于载玻片上进行复染；

（8）使用倒置荧光显微镜进行成像。