[发明专利]一种用于生产手性苯乳酸的基因工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种一种生产手性苯乳酸基因工程菌及其制备方法与应用，涉及基因工程领域领域，通过将L‑氨基酸脱氨酶、亚磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的编码基因构建于载体，转入宿主菌株获得基因工程菌，用于转化L‑苯丙氨酸制备L‑苯乳酸或D‑苯乳酸，通过利用亚磷酸脱氢酶催化无机亚磷酸盐来进行辅酶再生，避免了有机底物甲酸盐或葡萄糖的添加，提高了碳原子利用效率，是一种具有重要产业化前景的绿色生物合成技术。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种生产手性苯乳酸基因工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是高附加值的天然有机酸，可作为手性中间体广泛应用于化工、医药、农药和食品等领域。PLA有L-苯乳酸和D-苯乳酸两种对映异构体，都具有广谱抗菌性，可以作为生物防腐剂抑制多种食源性致病菌，抑菌活性和安全性能比一些常用化学食品防腐剂更强；也可以被添加于皮肤病治疗药物中，在化妆品行业中具有除皱、亮肤的美容功效；此外，还是抗HIV试剂和降血糖剂等药物的前体，比如PLA衍生物丹参素具有抑制血小板凝集和扩张冠状动脉的作用。

目前，工业生产苯乳酸的方法主要是化学合成法，该方法工艺复杂，需要高温高压，并会带来严重的环境污染。同时，化学合成法产物为D型和L型混合产物，难以得到单一手性的产物，分离纯化困难。微生物发酵法是合成苯乳酸的一种绿色生产方式，但是通常产物浓度低、效率低，增加了后续分离精制的成本，不适合工业化生产。

随着合成生物和酶催化技术的不断发展，全细胞催化技术已经在医药、化工和食品等领域用于原料物质的生产，目前关于手性苯乳酸生物催化合成的研究日益增多。2018年，Zheng等人在大肠杆菌中表达了L-氨基酸脱氨酶，甲酸脱氢酶，L-乳酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶，合成了59.9mM的L-苯乳酸或者60.3mM的D-苯乳酸(Zheng,Z.,et al.Enhancedbiosynthesis of chiral phenyllactic acid from L-phenylalanine through a newwhole-cell biocatalyst.Bioprocess Biosyst.Eng.2018,41:1205-1212)；2018年，Wang等人在大肠杆菌中表达了L-氨基酸脱氨酶，L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，将30g/L的苯丙氨酸几乎完全转化为L-苯乳酸(Wang,X.,et al.A new approach for efficient synthesisof phenyllactic acid from L-phenylalanine:Pathway design and cofactorengineering.J.Food Biochem.2018,42:e12584)；2019年，Hou等人在大肠杆菌中表达了L-氨基酸脱氨酶，乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，利用L-苯丙氨酸合成了54g/L的L-苯乳酸(Hou,Y.,et al.Combination of multi-enzyme expression fine-tuning and co-substratesaddition improves phenyllactic acid production with an Escherichia coliwhole-cell biocatalyst.Bioresour.Technol.2019,287:121423)；2022年，Zhang等人在毕赤酵母中共表达了L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，将400mM的苯丙酮酸转化为了359.8mM的L-苯乳酸(Zhang,D.,et al.Enantioselective biosynthesis of L-phenyllacticacid from phenylpyruvic acid in vitro by L-lactate dehydrogenase couplingwith glucose dehydrogenase.Front.Bioeng.Biotechnol.2022,10:846489)。但是，这些方法通常利用乳酸脱氢酶偶联甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生，需要在反应体系中加入较高浓度的有机底物甲酸盐或葡萄糖，降低了合成体系的碳利用率，增加了成本。