[发明专利]基于光电化学和双链特异性核酸酶的体外piRNA检测方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于光电化学和双链特异性核酸酶的体外piRNA检测方法。该方法包括以下步骤：制备MoS₂@ReS₂/Ti₃C₂光活性复合材料以及SiO₂复合探针系统，组装传感器。滴加待测样本，与DSN室温反应完成后，用超纯水将样本冲洗在抗坏血酸电解质溶液中进行PEC测量。MoS₂@ReS₂的Ⅰ型异质结构以及Ti₃C₂的高电导率有利于抑制电子‑空穴对的复合，提高靶响应；在piR‑31143存在时，piR‑31143会启动链置换反应将p2从复合探针系统中置换出来，随后DSN酶特异性识别DNA‑RNA复合体，裂解p1探针并释放piR‑31143继续参与下一轮置换及切割反应，形成恒温信号放大。本发明操作简便、灵敏度高、重复性和特异性好，是一种用于piRNA体外检测的可靠方法，基于此方法可以实现结直肠癌的精准诊断。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于光电化学和双链特异性核酸酶的体外piRNA检测方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因。最近的报道显示，亚洲国家结直肠癌发病率在过去20年里急剧增长，尤其是中国结直肠癌患病人数在过去的30年间增长了700%，超过美国成为全球结直肠癌患病人数最多的国家。CRC的发展是多种遗传和表观遗传改变逐步累积的结果，肿瘤的异质性较强，易导致CRC患者漏诊。鉴于这一临床挑战，寻找更能代表疾病生物学特征的新分子靶点，将对改善CRC患者的诊断和治疗具有重要价值。

piRNAs是一类新近发现的长度为26-31个核苷酸的小型非编码RNA，与PIWI蛋白相互作用，可在转录后和表观遗传上沉默生殖干细胞的转座元件。此外，有报道称piRNAs在体液中的表达水平失调与多种癌症的发生发展有关，且由于其体积小，3’端存在2’-O-甲基化修饰，因此piRNA不易被核糖核酸酶降解，是一种理想的肿瘤标志物。piR-31143是最早被确认与恶性肿瘤相关的piRNAs之一，因其调控DNA甲基化的功能而备受学者关注，最近的一项研究表明，其血清表达水平在CRC诊断中具有良好的应用前景。

目前，研究循环RNA的金标准方法是实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），敏感度和精确度均较高，但是该技术耗时长、需要专门的设备以及严格的温度控制，无法满足临床中简单、快速的检测需求。光电化学（PEC）是指光活性材料在光的照射下发生电子激发和电荷转移的光电转换过程。该技术以光源为激发源，激发光敏材料，输出电信号作为检测信号，实现对目标分子的检测，因此PEC生物分析具有背景信号低、灵敏度高的特点。随着新材料和信号放大策略的开发，在过去的几年光电化学得到了快速发展，为piRNA分析检测技术的研发提供了新的思路。因此，建立灵敏度高、特异性好、操作简单的微小RNA光电化学生物传感器不仅具有必要性，而且具有可行性。

发明内容

本发明针对传统piR-31143检测中存在的问题提出一种新型的基于光电化学和双链特异性核酸酶的体外piRNA检测方法。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

（1）MoS₂@ReS₂/Ti₃C₂复合材料的制备：将(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、NH₄ReO₄、CH₄N₂S和Ti₃C₂添加到超纯水中超声分散，转移至水热反应釜升温至220℃加热24h，自然冷却至室温后，用超纯水和乙醇洗涤黑色产物，真空干燥后得到复合材料。