[发明专利]一种siRNA体外稳定性检测方法

说明书

本发明属于基因治疗领域的检测方法，特别是一种利用动物肝匀浆处理siRNA并用非变性凝胶检测siRNA稳定性的方法。该方法包括体外降解siRNA体系和体外检测siRNA稳定性系统。

技术领域

本发明涉及siRNA基因治疗领域，具体涉及一种siRNA体外稳定性的检测方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference)是生物体重天然存在的一种在转录后通过小干扰RNA（siRNA）调控基因表达的机制。2006年诺贝尔生理与医学奖被颁给Craig C. Mello和Andrew Fire，以表彰他们在RNA干扰领域的研究。中心法则是现代生物学中最重要最基本的规律之一，主要包括：DNA可以转录成RNA，RNA翻译成蛋白质，DNA可以自我复制，RNA可以自我复制，RNA可以逆转录成DNA。RNA干扰的作用环节就是在信使RNA（mRNA）的水平，通过结合到RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）中，特异性结合到mRNA上将mRNA切割降解。由于RNA干扰的相对高效性和特异性，siRNA引起生物医学领域的广泛关注。

siRNA作为一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于基因突变、基因过表达引起的某些疾病的治疗。然而，直接递送未修饰的siRNA效果较差，原因是裸siRNA具有较低的稳定性与较差的药代动力学。因此，保持siRNA递送过程的稳定性、提高靶向性、提高内吞体逃逸、降低基因脱靶是提高siRNA临床转化的重要方向。

siRNA进入生物体内后，会被核酸内切酶或外切酶切割，导致无法发挥作用，因此各大药企通常会对siRNA进行修饰，主要包括对核糖、主链和碱基的修饰。核糖上的修饰包括氟基化、甲氧乙基化、甲氧基化修饰，主链上的修饰主要是硫代磷酸，碱基上的修饰主要是GNA、LNA、UNA等，核糖和主链上的修饰主要作用是提高稳定性，碱基上的修饰主要作用是增强链选择性、降低脱靶。然而修饰也不是越多越好的，有些修饰例如氟代、硫代磷酸太多，往往毒性会增大，同时siRNA的活性也会受到影响，且修饰模式可能具有序列依赖性，所以在设计siRNA的修饰时需要进行体外活性和稳定性的检测。

发明内容

目前体外检测siRNA稳定性的方法是用核酸外切酶、内切酶、动物血清、组织匀浆处理siRNA后用LC-MS或qRT-PCR的方法检测降解率，但是LC-MS的方法开发难度大，qRT-PCR检测方法受到代谢产物的影响，因此本发明提供一种体外快速鉴定修饰siRNA稳定性的方法。

本发明提供的技术方案包括：一种体外处理修饰siRNA的体系和体外检测siRNA的体系。

附图说明：

图1 Buffer A肝匀浆处理siRNA稳定性胶图；

图2 Buffer B肝匀浆处理siRNA稳定性胶图。

具体实施方式：

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明通过用将新鲜动物肝组织进行匀浆，使细胞中的核酸酶释放出来，利用肝脏组织中的核酸酶降解siRNA更加接近在体情况。在本发明的一些实施例中，对肝组织进行匀浆的匀浆液可以是磷酸盐缓冲体系、Tris盐缓冲体系、柠檬酸盐缓冲体系等，优选地，缓冲体系为Buffer A (Na₂HPO₄ 8mM，NaCl 136 mM，KH₂PO₄ 2 mM，KCl 2.6 mM， pH为7.2~7.4)或者Buffer B (100 mM Tris，1 mM MgCl₂，pH为5.9~6.1)。