[发明专利]一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用

说明书

本发明具体公开一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，以及在V.vulnificus检测中的应用，实现了无需昂贵仪器设备的V.vulnificus现场检测，且检测结果肉眼可见；本发明中将等温扩增技术RPA与核糖开关相耦合，检测V.vulnificus保守序列的灵敏度为4.30×10supgt;3/supgt;copies/μL；经冷冻干燥后的TX‑TL核糖开关检测体系，其活性有所下降，但仍然可实现V.vulnificus保守序列的检测。本发明还通过TX‑TL核糖开关检测体系的重复性试验和特异性试验，证明了该检测方法稳定性好，特异性强，适用于V.vulnificus病原微生物的检测。

技术领域

本发明属于病原微生物检测及分子诊断的技术领域，具体涉及一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用。

背景技术

V.vulnificus是海洋中最常见的弧菌科细菌之一，广泛分布在近岸海域的海水、海洋生物的体表和肠道中，人类感染这种细菌一般有两种途径：使用海鲜与接触海水或海产品。V.vulnificus是一种危险的人类病原体，是所有食源性病原体中病死率最高的。V.vulnificus感染的特点是潜伏期短，通常在感染的24h内就会出现症状，在48h内出现感染性休克、皮肤肌肉坏死、脓毒血症，进而引起多脏器功能衰竭，伤口感染的总死亡率约为25％，但在患有潜在肝病的患者中上升至54％。由于这种细菌可引起严重感染，及时进行抗菌治疗是必不可少的。因此，在临床环境中准确快速地识别这种细菌是至关重要的。

大多数临床微生物学实验室仍然依靠培养来检测临床样本中的V.vulnificus。例如，使用选择培养基分离特定目标病原体，分离出细菌后，利用MALDI-TOF MS鉴定V.vulnificus，其检测具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。但是依靠培养来检测临床样本中的V.vulnificus的方法仍存在一些局限性，检测时间通常需要16～48h，且无法检测一些难以进行分离培养的病原微生物，因此，目前主要用于培养基础上的鉴定。近年来，使用PCR检测手段得到快速发展，可进行种属水平的鉴定，各种以PCR为基础的DNA扩增技术如荧光定量RCR、逆转录PCR、数字PCR等技术，已成为医学临床和检验部门强有力的分析工具，

在实际应用场景下，待检测样本中病原微生物含量低，需经过核酸扩增获取大量目标基因片段，因此，PCR检测手段进行V.vulnificus的快速识别成为一种具有较大发展潜力的方法。但是，现有的各种PCR技术需要热循环过程，无法摆脱对仪器设备的依赖，从而限制了其在临床现场检测V.vulnificus中的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关及其制备方法，并将制得的基于无细胞转录翻译系统的核糖开关用于现场即时检测V.vulnificus。

本发明的技术方案如下：

本发明目的之一在于提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，所述核糖开关是根据细菌保守序列RNA设计的具有立足结构的RNA序列，可与V.vulnificus保守序列RNA发生碱基互补配对，激活报告蛋白的表达；所述核糖开关是由两条RNA链组成，分别为Sensor RNA和Trigger RNA，Sensor RNA为核糖开关，Trigger RNA用于激活核糖开关；Sensor RNA序列由Sensor DNA序列体外转录而来，Trigger RNA序列由Trigger DNA序列体外转录而来。

进一步的，所述Trigger DNA序列是由带有pT7启动子的上游引物和下游引物从V.vulnificus中等温扩增而来，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，Trigger DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述Sensor DNA序列是可编程的，根据所选择的V.vulnificus保守序列Trigger DNA设计而来，Sensor DNA序列如SEQ ID NO:4所示。