[发明专利]一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用

说明书

本发明公开了一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，所述李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，缺失hly基因，第211‑215位氨基酸而得，最终所得减毒株命名为LAPAD1115，其保藏编号为CGMCCNO：24070，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；本发明的单増李斯特菌的减毒株可用于活疫苗治疗载体或免疫佐剂；将hly基因第211‑215位缺失使该细菌毒力大大降低，达到安全级别，但仍保留了较为完整的免疫原性，由于是在李斯特菌基因组上进行缺失修饰，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，同时不会由于质粒的丢失而影响李斯特菌自身的生长。

技术领域

本发明涉及单核细胞增多性李斯特菌，特别涉及一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性胞内寄生病原菌。李斯特菌有着极强的生存能力且广泛分布于各种环境中，能够在许多不同的环境中持续生存，极易感染免疫力低下的人群，造成细菌性败血症、胃肠炎、脑膜炎以及流产等李斯特菌病。

近年来，科研界通过对李斯特菌的研究发现，其可作为一种有前景的疫苗载体，呈递肿瘤相关抗原，并且在人乳头瘤病毒，前列腺癌，黑色素瘤，转移性乳腺癌等方面都有着不错的成效。减毒活载体疫苗的特点是能引起较强的免疫反应，由于单増李斯特菌能在巨噬细胞内增殖，其能够更好的递呈抗原，除此之外，已知单増李斯特菌LLO能够增强抗原的特异性免疫反应，但是传统的减毒策略主要是毒力基因的缺失、质粒回补等，存在对机体安全性不够、免疫原性低、抗原呈递效率不高等局限性。因此，本发明的减毒策略以及获得的减毒活载体疫苗能有效地解决传统疫苗面临的技术缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种减毒单增李斯特菌的构建策略，所述李斯特菌是以单増李斯特菌野生株(WT)为背景，缺失hly基因(编码溶血素LLO蛋白)第211-215位氨基酸(AYSES)而得，最终所得减毒株命名为LAPAD1115，其保藏编号为CGMCCNO：24070，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了一种减毒菌株，含有前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌。

本发明还提供了所述减毒单核细胞增多性李斯特菌毒力致弱，可作为活疫苗载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述减毒单增李斯特菌制备方法包括以下步骤：

(1)构建重组质粒pSL2878；

(2)制备WT感受态细胞；

(3)利用所述步骤(1)制备的重组质粒对所述步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)WT与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(1)具体包括：

以单核细胞增多性李斯特菌WT的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取上游同源臂、下游同源臂，设计引物扩增上、下游同源臂，条带大小分别为533bp和423bp，作为片段A和片段B，其中上游同源臂为hly基因上第33-210位氨基酸，下游同源臂为hly基因上第216-348位氨基酸。

通过重叠PCR技术(SOE-PCR)将两个片段连在一起，获得A-B目的片段。

以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2878。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(2)具体包括：