[发明专利]一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法

权利要求书

1.一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将待测样本的DNA提取；

S2：基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic di-GMP phosphodiesterase基因序列作为检测靶序列，以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2，所述P1与P2的序列如下：

上游引物P1:5'TTGTACTATTTTTAACAAACTTGGCTA3'，

下游引物P2:5'CCTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'；

S3：以待测样本的DNA为模板，通过上游引物P1与下游引物P2对进行实时荧光PCR扩增检测，进行电泳分析，即完成鉴定。

2.根据权利要求1所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述将待测样本的DNA提取包括从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或从待检鱼组织中提取DNA。

3.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA包括以下步骤：挑取美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落到液体培养基中进行摇床培养过夜，去除上清液后加水混合后，继续离心，再次去除上清液后加水得到混合液，将混合液置于沸水中水浴加热3-7分钟后取出，再次离心后取上清液，所述上清液即为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种DNA提取液。

4.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述从待检鱼组织中提取DNA包括以下步骤：取待检测组织进行裂解离心，提取沉淀溶于无菌水即得美人鱼亚种DNA。

5.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述PCR扩增检测的反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μl，模板DNA 1μl，ddH₂O9.5μl，10μM的上下游引物各1μl。

6.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述PCR扩增检测的反应条件为：94℃变性2min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸2min。

7.根据权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述电泳分析具体包括：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具有可见条带的为受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组织，反之则为未受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组织。