[发明专利]一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的免疫荧光试剂盒及其方法

说明书

本发明公开一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER‑2的免疫荧光试剂盒，包括A液、B液、C液和D液，所述A液包括有多聚甲醛，所述B液包括有牛血清白蛋白和曲拉通X‑100，所述C液包括有牛血清白蛋白、曲拉通X‑100、抗细胞角蛋白荧光抗体、抗HER‑2荧光抗体，所述D液包括有抗荧光淬灭封片液。本发明采集患者少量血液样本，通过抗体筛选和优化，对两个靶蛋白CK和HER‑2均采用直接标记荧光抗体，从而简化操作，重点定位HER‑2表达强度的检测，对HER‑2抗体进行筛选与优化，可以有效区分HER‑2高、中、低表达水平，采用了两种CK抗体，抗CK19抗体和抗广谱CK抗体，有效区分CTCs和正常血液细胞。

技术领域

本发明涉及细胞标志物分子检测技术领域，具体为一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的免疫荧光试剂盒及其方法。

背景技术

近年来帕妥珠单抗、拉帕替尼、吡咯替尼和恩美曲妥珠单抗等新的抗HER-2药物不断研发成功上市，改变了乳腺癌的诊治模式，大大改善了人表皮生长因子受体-2(Humanepidermal growth factor receptor 2，HER-2)阳性乳腺癌患者的预后，改变了临床实践，目前临床常规的HER-2检测手段为采集患者组织样本进行免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)。IHC检测的是细胞膜上的HER-2蛋白的表达情况，而FISH是以17号染色体着丝粒探针杂交信号的比率来判断HER-2基因是否有扩增。

近年来，以循环肿瘤细胞(circulating tumour cells，CTCs)为主的体液肿瘤细胞的检测可为上述局限性提供一些解决方案。CTCs是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，CTCs的检出提示体内原发灶或转移灶的存在，或癌前病变细胞的存在，是转移病灶形成的“种子”细胞，是肿瘤发生发展的直接证据。CTCs检测作为液体活检的热门领域，在肿瘤诊断、治疗和监控等方面极具发展潜力，作为肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段具有很高的临床价值。临床研究证明了CTCs检测在包括HER-2阳性、三阴性在内的各个亚型转移性乳腺癌中的预测价值。

当前CTCs HER-2的检测，在CTCs的分离和富集以及HER-2的检测上也有不同的策略。CTCs的分离和富集，一般根据富集原理可分为生物化学特性富集法(免疫亲和法)和物理特性富集法，以及两者综合利用的方法，其中使用最广泛的是免疫亲和法。CTCs富集后HER-2的检测除了临床上组织检测常用的IHC和FISH外，还包括PCR以及免疫荧光等方法。与本发明相似的技术方案即为免疫荧光检测法，包括有：

专利201811523965.3公布了一种循环肿瘤细胞表面标志分子HER2的检测方法，其主要步骤包括：1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；2)细胞经封闭后，以细胞角蛋白(cytokeratin，CK)抗体anti-CK和抗HER-2一抗孵育；3)用标记有FITC荧光基团的HER-2二抗孵育；4)再加入细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞；5)荧光显微镜选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，即实现对循环肿瘤细胞表面标志分子HER-2的检测。

专利201810908228.9公布了一种检测HER-2抗原不同位点的免疫荧光试剂盒及应用，其核心在于加入针对HER-2胞内段和胞外段的抗体和相应的荧光二抗对HER-2阳性细胞进行鉴定，同时通过对染色结果进行分析，可以将HER-2阳性细胞分为高、中、低表达亚型。主要步骤包括：1)采用已知的方法富集非体液性稀有有核细胞；2)使用室温或类似条件使玻片自然干燥，使用固定剂固定细胞及抗原；3)进行免疫荧光检测，其中使用的抗体为直接标记CD45荧光抗体以及两种需要使用荧光二抗的HER-2抗体；4)荧光显微镜检测。

现有技术的不足：