[发明专利]一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用，所述单克隆抗体能够特异性结合猪免疫细胞早期激活标志CD69膜蛋白。一种单克隆抗体所识别的抗原表位位于猪CD69蛋白氨基酸序列的140‑162位，其氨基酸序列为：140‑AEHWIGLKNEDGQTWKWSNGKEF‑162。通过本发明，本发明所要解决的技术问题是研制出能够在流式细胞术染色中特异性识别表达CD69分子的活化的猪淋巴细胞的单克隆抗体。还要解决的技术问题是提供抗猪CD69的单克隆抗体的科学完善的制备方法。同时要解决的技术问题是提供内容所述的抗猪CD69的单克隆抗体在鉴定猪CD69的其它相关试验技术方面的应用性。还要解决的技术问题是提供了该单克隆抗体的抗体类型和亚型类别。

技术领域

本发明涉及一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途，特别涉及特异性识别和鉴定早期活化的免疫细胞的单克隆抗体、制备方法及其检测应用，属于生物科学和诊断试剂领域。

背景技术

淋巴细胞的早期激活表面标志物CD69(以前也称为EA1、MLR3、AIM、Leu23或BL-Ac/p26)是C型凝集素超家族的II型膜蛋白(1)。CD69是已知的免疫细胞早期激活分子，可在活化的B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞和粒细胞上表达(2-4)。在实验条件下，佛波酯(PMA)体外刺激1小时可诱导T细胞表达CD69，因而检测CD69可很好地指示T细胞的早期激活(2)。通过检测CD69的表达分析免疫细胞的激活状态在人类和小鼠模型上已经广泛开展。但通过检测猪CD69分子的表达来分析猪免疫细胞激活状态的研究几乎还是空白。其关键原因是，缺乏特异性检测猪CD69分子的免疫学工具。

猪CD69蛋白序列全长200个氨基酸，含有38个氨基酸的胞内区、26个氨基酸的跨膜区，136个氨基酸的保外区(5)。虽然有日本学者制备了抗猪CD69分子的单抗，但能否用于检测猪感染和免疫条件下免疫细胞的激活尚不明确。目前对于猪淋巴细胞免疫激活的评价可借助间接方法来实现，如IFN-γ酶联免疫斑点法(ELISpot)、细胞因子胞内染色法等(6,7)。这些方法主要是检测淋巴细胞的晚期激活，而且通常难以区分被激活的细胞类型或者敏感性远不如检测CD69分子的表达。此外，CD69可与鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1Pr1)结合形成复合物抑制该受体介导的细胞迁移，因而T细胞上调CD69的表达往往代表着T细胞在局部的激活与增殖(8)。而且，CD69的诱导表达也伴随着转录因子AP-1和IL-2的表达增加，进而诱导细胞毒性T细胞的产生(9)，最终导致适应性细胞免疫的建立。猪繁殖与呼吸综合征、猪流行性腹泻、猪圆环病毒病等猪病是困扰我国养猪业的顽疾，非洲猪瘟更是给我国养猪业造成了毁灭性的打击。现有的研究更多聚焦于这些病毒诱导的体液免疫反应，通过检测病原特异的抗体滴度来衡量疫苗的保护效果。而对于细胞免疫在其中扮演什么角色目前知之甚少，严重制约了针对这些猪病的疫苗开发和免疫保护机理的研究。本发明通过制备一种特异性识别猪CD69的单克隆抗体，结合不同的猪CD分子标记，通过流式细胞术(FCM)，可以实现直接评估在感染、免疫或体外刺激后不同的猪免疫细胞的活化情况，可用于猪蓝耳病等猪病的疫苗评价、药物筛选以及免疫保护机理解析，是一个非常重要的免疫学工具。

发明内容

本发明的目的就是正对上述问题，提供一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO:C202278的杂交瘤产生。所述杂交瘤的名称(分类命名)为：杂交瘤细胞株5F12；保藏日期为：2022年5月19日；保藏单位全称为：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称为：CCTCC；保藏编号为：CCTCC NO:C202278；保藏地址为：中国武汉武汉大学。

所述单克隆抗体能够特异性结合猪免疫细胞早期激活标志CD69膜蛋白。

一种单克隆抗体所识别的抗原表位位于猪CD69蛋白氨基酸序列的140-162位，其氨基酸序列为：

140-AEHWIGLKNEDGQTWKWSNGKEF-162。