[发明专利]抗人嗜铬粒蛋白A(CHGA)鼠单克隆抗体及其用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种由杂交瘤细胞株OTI8H7(保藏编号为CGMCCNO.22346)分泌的抗人嗜铬粒蛋白A(CHGA)鼠单克隆抗体。本发明还涉及OTI8H7分泌的单克隆抗体在制备用于检测CHGA蛋白的免疫检测工具中的应用，包含免疫组织化学检测试剂盒与标记肿瘤试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CHGA蛋白特异性结合，显著提高了CHGA蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株OTI8H7分泌的单克隆抗体与人嗜铬粒蛋白A(CHGA)特异性结合用于免疫检测的方法和应用。

背景技术

嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A)又称嗜铬素A是由CHGA基因编码，有457个氨基酸组成的一种可溶酸性细胞蛋白，分子量为50kDa。最初在肾上腺的嗜铬粒细胞的分泌颗粒中被发现，现研究发现其在交感神经、心肌、胰腺、中枢和周围神经系统、肠道内分泌组织、甲状腺和甲状旁腺等组织中均有表达。几乎所有的神经内分泌肿瘤均可检测到嗜铬素A，阳性程度取决于致密核心颗粒的数量。抗体主要用于标记神经内分泌肿瘤，也可用于甲状腺髓样癌和滤泡癌的鉴别诊断，甲状腺髓样癌阳性，而甲状腺滤泡样癌阴性。

免疫组织化学(简称免疫组化，Immunohistochemistry，IHC)在临床常用来做恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断、确定转移性恶性肿瘤的原发部位、肿瘤分型等。嗜铬素A的表达特征决定了它是一种良好的诊断标记物。因此，研制出一种特异性较高的针对嗜铬素A蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与嗜铬素A蛋白特异性结合的单克隆抗体，及其在用于检测嗜铬素A蛋白的免疫检测工具中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种能分泌抗嗜铬素A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 OTI8H7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为 CGMCC)，保藏日期为2021年5月21日，保藏编号为CGMCC NO.22346。本发明还提供了一种特异性结合嗜铬素A的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株 OTI8H7分泌。

本发明所述单克隆抗体制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：基因合成嗜铬素A核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， ORF长度为：651bp，表达嗜铬素A蛋白241-457氨基酸序列，氨基酸长度为 217aa，具体序列如SEQ ID No.2所示。将合成的嗜铬素A的ORF插入表达载体pET23a-His，构建嗜铬素A的重组表达质粒pET23a-His-rCHGA。

(2)重组嗜铬素A蛋白的表达与纯化：将构建的嗜铬素A重组表达质粒转化 E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的重组嗜铬素A蛋白。

(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组嗜铬素A蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA和IHC法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗嗜铬素 A蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗嗜铬素A蛋白单克隆抗体。通过IHC检测方法验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够分泌抗嗜铬素A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为OTI8H7，亚型鉴定为IgG1，并与2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO.22346。

本发明还提供了由杂交瘤细胞株OTI8H7分泌的单克隆抗体在制备用于检测嗜铬素A蛋白的免疫检测工具中的应用。

作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。