[发明专利]一种同时制备新科斯糖和1

权利要求书

1.一种同时制备新科斯糖和¹F-低聚果糖的方法，步骤是：

(1)制备红发夫酵母来源⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV基因表达盒：以黑曲霉ATCC 20611的基因组DNA为模板，以FopA-1UF/FopA-1R为引物扩增β-呋喃果糖苷酶FopA编码基因启动子及信号肽基因PfopA-SP；然后将β-呋喃果糖苷酶FopA编码基因启动子及信号肽基因PfopA-SP、Xd-INV编码基因、终止子基因TtrpC、抗性基因prtA按顺序连接，制得能随机整合进入黑曲霉ATCC 20611基因组中表达Xd-INV蛋白的Xd-INV表达盒，其中所述Xd-INV表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述β-呋喃果糖苷酶FopA编码基因启动子及信号肽基因PfopA-SP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Xd-INV编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述的终止子TtrpC基因来源于质粒pAN7-1；所述的抗性基因prtA扩增于质粒T-prtA；所述引物核苷酸序列如下：

FopA-1UF：ATTGTGTCATTATAGCTCTTTCT；

FopA-1R：TGAGGCTTCTGCTGCTGC；

(2)构建共表达异源⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV和β-呋喃果糖苷酶FopA的工程菌株：制备黑曲霉ATCC 20611的原生质体，将红发夫酵母来源⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV基因表达盒转化进入黑曲霉ATCC 20611的原生质体，经筛选、验证，验证正确的菌株命名为共表达异源⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV和β-呋喃果糖苷酶FopA的工程菌株INCF-1；

(3)发酵生产⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV和β-呋喃果糖苷酶FopA：将活化后的工程菌株INCF-1以10⁶个/ml的数量接种到发酵培养基中，在温度30±3℃、转速180-220r/min条件下发酵1-7天，即得到含异源⁶G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV和β-呋喃果糖苷酶FopA的菌丝体；其中，所述发酵培养基配方是：蔗糖38±2g/L，酵母膏3±1g/L，NaNO₃ 4±1g/L，K₂HPO₄ 0.4±0.2g/L，MgSO₄7H₂O 0.5±0.1g/L，FeSO₄ 0.01±0.05g/L，CuSO₄ 0.01±0.05g/L，pH 4.5±1.0，115℃，灭菌30min；

(4)利用含β-呋喃果糖苷酶菌丝体同时制备新科斯糖和¹F-低聚果糖：测定得到的含酶菌丝体的总酶活，确定制备低聚果糖的反应体系为：400-446U/g酶的菌丝体量为7-35g/L，蔗糖浓度为200-600g/L，温度为20-60℃，转速为150-200r/min；反应5-30h即获得含新科斯糖和¹F-低聚果糖的反应液。

2.根据权利要求1所述同时制备新科斯糖和¹F-低聚果糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述发酵培养基配方是：蔗糖40g/L，酵母膏3g/L，NaNO₃ 5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄7H₂O0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，CuSO₄ 0.01g/L，pH 5.0。

3.根据权利要求1所述同时制备新科斯糖和¹F-低聚果糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述工程菌株INCF-1的发酵条件是：温度为30℃，转速为200r/min，发酵时间为2天。