[发明专利]纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建与应用

权利要求书

1.一种纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株，其特征在于：所述菌株命名为QCDS，该菌株是以里氏木霉QEB4为出发菌株，在其基因组中构建了含有以组成型启动子Pcdna1表达的xyr1基因即xyr1过表达盒，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，同时含有以纤维素诱导型启动子Pegl2表达的sec63基因即sec63过表达盒，其核酸序列如SEQ IDNO.2所示；其中xyr1基因被整合到hph位点上，该xyr1基因的上游为启动子Pcdna1，下游为xyr1本源的终止子，抗性基因ptrA位于上游同源臂和启动子Pcdna1之间；sec63基因上游为启动子Pegl2，下游为sec63本源的终止子。

2.权利要求1所述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株的构建方法，步骤是：

(1)以里氏木霉QEB4基因组为模板，利用引物对Cdna1-F/Cdna1-R扩增组成型启动子Pcdna1的核苷酸序列；以里氏木霉QEB4基因组为模板扩增xyr1基因及其终止子区域，利用引物对Hph-UF/Hph-UR、Hph-DF/Hph-DR分别扩增hph基因的上下游同源臂，然后将其上游同源臂、抗性基因ptrA、Pcdna1、xyr1基因及其终止子、下游同源臂按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为xyr1过表达盒，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中所述引物核苷酸序列如下：

Cdna1-F：TTCGCCTAACCAGCATAA；

Cdna1-R：GATCAATCCAACAACTTCTCTC；

Hph-UF：GCTGTTCTCCAAGGCGTCA；

Hph-UR：AACAAAGATGCAAGAGCGGGGAGCCGAGAGGGTAGTAATG；

Hph-DF：AGAAAGGCATTTAGCAAGAAGG；

Hph-DR：TTCAGGGCGAAGCTGTCC；

(2)以里氏木霉QEB4为出发菌株，制备该里氏木霉QEB4原生质体，然后将步骤(1)构建的xyr1过表达盒转化进入里氏木霉QEB4的原生体中，经筛选、验证，验证正确的菌株命名为里氏木霉纤维素酶高表达菌株QCDX；

(3)以里氏木霉QEB4基因组为模板，利用引物对Egl2-F/Egl2-R扩增纤维素诱导型启动子Pegl2的核苷酸序列，利用引物对Sec63-F/Sec63-R扩增sec63基因及其终止子区域，然后将抗性基因hph、Pegl2、sec63基因及其终止按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为sec63过表达盒，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中所述引物核苷酸序列如下：

Egl2-F：AAACACCTCGCTCCAGTGC；

Egl2-R：TGTCGATGACGGGGAGATAT；

Sec63-F：CTCCCCGTCATCGACAGCCAAGATGAGCTCAGACTACTC；

Sec63-R：TTCTGCTATTGCCAAGTTGAAAGCAGACGGGCTGTCATTG；

(4)制备里氏木霉纤维素酶高表达菌株QCDX的原生质体，将步骤(3)构建的sec63过表达盒转化进入里氏木霉QCDX的原生质体，经筛选、验证，验证正确的菌株即为命名为纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株QCDS。

3.权利要求1所述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株在发酵生产纤维素酶中的应用。