[发明专利]基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于4‑氨基‑2‑巯基嘧啶‑5‑羧酸乙酯的花菁探针及其制备方法和应用。首先制备CY5.5染料，然后将CY5.5染料与N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)反应形成活性酯，最后与4‑氨基‑2‑巯基嘧啶‑5‑羧酸乙酯在碱性条件下反应，所得粗品通过薄层色谱法分离，得到最终产物CY5.5O。本发明制备得到的花菁探针具有优良的光学性能并且可以通过荧光变化的方式选择性识别溶菌酶。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针及其制备方法和应用。

背景技术

溶菌酶是一种由动物产生的抗菌酶，作为先天免疫系统的一部分，广泛存在于巨噬细胞和多形核中性粒细胞的胞浆颗粒中。在人类社会中，溶菌酶被用作多种牛奶和药品中的食品添加剂，具有抗微生物、抗病毒、抗肿瘤等特殊功能。另一方面，某些癌症(特别是骨髓单核细胞白血病)能引发机体产生过量的溶菌酶。因此，检测机体中溶菌酶的含量可以辅助诊断癌症及其并发症，包括肾衰竭、白血病、脑膜炎和低血钾等。

目前，分析溶菌酶的手段主要有：酶联免疫吸附试验、质谱检测、高效液相色谱等，这些传统手段都存在一些缺点，繁琐的样品预处理、低选择性、高成本等。医院检测溶菌酶依然运用琼脂平板培养和比浊法，但两种方法都无法平衡可靠性和检查周期。

考虑到检测溶菌酶的重要性，迫切需要一种快速检测和低成本的方法。目前，荧光探针法因为设计灵活和检测快速等优势已经在许多科学领域得到应用。因此，开发新型荧光探针检测溶菌酶具有重要意义。

发明内容

为了克服现有荧光传感器的选择性低和灵敏度较低，毒性较大的不足，本发明提供了一种基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针，该探针的结构式为：

本发明还提供了一种基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针的制备方法：

(1)蓝绿色固体CY5.5染料的制备；

(2)将花菁染料CY5.5与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)搅拌1～3小时形成活性酯；

所述花菁染料CY5.5与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的摩尔当量比为：1:2.5～1:4；

花菁染料CY5.5与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的摩尔当量比为1:2～1:4。

(3)然后加入4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯并在碱性条件下(DIPEA)室温反应30～48小时，最后通过薄层色谱法提纯得到基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针CY5.5O。

所述花菁染料CY5.5形成的活性酯与4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的摩尔当量比为：1:2.4～1:4；

薄层色谱法提纯所用展开剂为体积比为45:1～35:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液。

以上制备方法的化学反应为：

本发明还提供了一种上述染料探针的应用：所制备的基于4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯的花菁探针在浓度为10mM的缓冲溶液PBS与浓度为4mM的表面活性剂SDBS的混合溶液中，快速简便地检测溶菌酶，其中，缓冲溶液PBS与表面活性剂SDBS的体积比为3:1～9:1。

花菁染料CY5.5是一种共轭的荧光基团，收到特定波长的激发能够产生强的荧光。当特异性的能够识别溶菌酶的4-氨基-2-巯基嘧啶-5-羧酸乙酯与花菁染料CY5.5通过酰胺键链接后，形成了最终花菁探针CY5.5O。它在识别溶菌酶后，荧光强度有了显著的增强，从而达到了检测溶菌酶的目的。