[发明专利]一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，包括a)初次孵育：将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：1～8的摩尔比例进行混合并孵育；b)二次孵育：将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：8～16的摩尔比例进行混合并孵育；c)外周血样本准备；d)外周血单个核细胞准备；e)三次孵育：将6～10ul的步骤b)中所制备的Dodecamer与3～7ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞进行混合并孵育；f)鉴定和分选和g)染色和鉴定。本发明引入了生物蛋白Dodecamer，该Dodecamer蛋白基于一个四聚体骨架蛋白，利用生物素与链霉亲和素特异性结合的原理最终偶连抗体，可用于检测血液中抗体阳性的CTCs，检测灵敏度高。

技术领域

本发明涉及循环肿瘤细胞检测的技术领域，特别是一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法的技术领域。

背景技术

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells, CTCs），即因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶或转移灶）脱落而进入外周血液循环中的肿瘤细胞。虽然大部分CTCs在进入外周血液循环中，会被人体免疫系统杀伤、自身发生凋亡或者被血流和血管壁等碰撞而发生破碎，然而仍存在少数CTCs可能逃逸并锚着发展为转移灶，进而增加恶性肿瘤患者的死亡风险。由于CTCs携带肿瘤和转移组织的遗传和表型的生物学信息，因而对CTCs进行检测有助于肿瘤的临床进展、疗效与预后评估以及肿瘤复发监控。

目前，有多种针对肿瘤患者血液中的CTCs分离方法，主要包括基于CTCs的生物学特性和物理特性的两大类分离方法，即免疫亲和富集法（根据细胞表面表达的特异性的蛋白将CTCs筛选出来）和物理特性富集法（根据CTCs的大小和密度等特性将CTCs筛选出来）。其中，基于循环肿瘤细胞表面标志物（如上皮肿瘤细胞标志物EpCAM和间质细胞标志物Vimentin等）捕获鉴定CTCs是最主要的方法之一。利用EpCAM等抗体，并通过流式细胞仪检测、磁珠分选或微流控芯片的方式可对CTCs进行鉴定和捕获分析。以流式细胞仪检测的方法为例，在获得患者的新鲜血液样本后，通过梯度离心等方法富集血液中的单个核细胞，将耦连荧光染料的EpCAM抗体与细胞样本孵育，再通过流式细胞仪检测荧光染料的信号来鉴定和捕获与EpCAM抗体结合的CTCs。

但是上述现有技术存在的问题和缺点是灵敏度较差，CTCs的检出率低。这是因为血液中的CTCs通常由于表型转化等原因，导致上皮标志物表达水平下降，进而导致存在相当比例的潜在CTCs上的EpCAM表达水平不高，而这些低表达EpCAM的CTCs很可能由于检测荧光信号太弱而造成遗漏和检出率下降。

发明内容

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，该Dodecamer蛋白基于一个四聚体骨架蛋白，利用生物素与链霉亲和素特异性结合的原理最终偶连抗体，可用于检测血液中抗体阳性的CTCs，检测灵敏度高。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：

a)初次孵育：将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：1～8的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到初次孵育产物；

b)二次孵育：将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：8～16的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到二次孵育产物，即为目标产物Dodecamer；

c)外周血样本准备：收集受试者的新鲜外周血样本；

d)外周血单个核细胞准备：从步骤c)中所收集的新鲜外周血样本内分离出外周血单个核细胞；