[发明专利]厌氧合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株及构建方法

说明书

本发明公开了厌氧合成5‑氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株及构建方法，方法为：将密码子优化的5‑ALA合成酶编码基因hemA^M，与载体pEC‑XK99E连接得到质粒psH；将基因sucCD与质粒psH连接得到质粒ps‑heCD；导入谷氨酸棒杆菌Cev‑18‑5中，得到菌株Cev‑18‑7；敲除基因pyc，得到菌株Cev‑18‑8；将基因aarC与质粒psH连接得到质粒psHA；替换菌株Cev‑18‑8中的质粒ps‑heCD，得到厌氧合成5‑氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株Cev‑18‑9；本发明构建的菌株实现了在厌氧条件下利用谷氨酸棒杆菌合成5‑ALA，达到了目前厌氧发酵合成5‑ALA的高产量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到厌氧合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株及构建方法及应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，5-ALA)作为一种非蛋白类氨基酸，是合成生物所必需的四吡咯类色素化合物的关键中间体，如卟啉、叶绿素、血红素和维生素B12等，广泛存在于动物、植物和微生物中。5-ALA作为一种内源性物质，对人和动物无毒且绿色高效，在环境中易降解且无残留，因此它在医药、食品和农业等领域得到了广泛的应用。在医药领域，有研究学者发现，在非洲绿猴Vero E6细胞中，联合使用5-ALA和柠檬酸亚铁钠(Sodium ferrous citrate，SFC)对新冠肺炎病毒SARS-CoV-2变异病毒具有抗病毒作用，且无细胞毒性。而且5-ALA和SFC联合使用存在剂量依赖关系，使用低浓度的5-ALA/SFC对SARS-CoV-2、Alpha和Delta毒株有抑制作用，而高浓度的5-ALA/SFC对Beta和Gamma毒株有抑制作用。最近，日本的研究人员发现5-ALA/SFC还能有效抑制人类结肠源Caco-2细胞中SARS-CoV-2病毒的感染，较高浓度的5-ALA(约78.13μM以上)或者5-ALA/SFC(约125μM/31.25μM以上)对病毒的抑制率达到100％。此外，5-ALA对患有COVID-19和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的患者的治疗也具有较大的潜力。研究者们观察了6位病人口服5-ALA的康复情况，单独服用5-ALA或者联合服用5-ALA/SFC有利于患者的恢复，这表明5-ALA对COVID-19的治疗具有明显效果。在农业领域，5-ALA能够调节和改善作物的生长情况，增加农作物的耐受性，如抗旱、耐热、抗寒和耐受重金属离子等。除此之外，高浓度5-ALA还能够被用作除草剂。

迄今为止，已经发现了许多制备5-ALA的化学合成路线，包括：(1)琥珀酸酐衍生物合成路线；(2)吲哚胺合成路线；(3)四氢呋喃胺的合成路线；(4)5-羟甲基-2-呋喃醛的合成路线；(5)甘氨酸的合成路线，等，但是它们都存在一定的缺点，如收率较低，工艺复杂，近些年，随着代谢工程和合成生物学的发展，生物合成法作为一种安全、经济、可持续的方法受到了研究者们的关注。利用生物合成方法替代化学合成法实现5-ALA的合成，已成为未来生产5-ALA的发展趋势。在自然界中，5-ALA的生物合成主要有两种途径，分别为C4途径和C5途径。C4途径以琥珀酰CoA和甘氨酸为前体物，通过5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，由hemA基因编码)一步催化生成5-ALA，与C5途径相比较，它的合成途径更短，催化机理更简单，因而被广泛应用于5-ALA的生物合成。

目前，有文献报道了在厌氧条件下利用大肠杆菌合成5-ALA。2007年，Shin等人在厌氧条件下，以葡萄糖为碳源，外源添加甘氨酸，同时表达maeB和hemA的大肠杆菌5-ALA产量仅为54.7mg/L。而谷氨酸棒杆菌是生物合成5-ALA的主要工程菌株之一，具有极大的应用潜力。且有研究证实大肠杆菌来源的琥珀酰CoA合成酶(基因sucCD编码)能够使琥珀酸在厌氧条件下有效地转化为琥珀酰CoA，更有利于5-AlA的合成，相比于好氧条件，厌氧具有成本低，可固定CO₂等优势。目前，尚未有利用谷氨酸棒杆菌厌氧合成5-ALA的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供厌氧合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株。