[发明专利]玉屏风散总多糖佐剂的制备及其在新城疫疫苗中的应用

说明书

本发明提供了一种玉屏风散总多糖佐剂的制备及其在新城疫疫苗中的应用，并首次优化了玉屏风散总多糖佐剂制备工艺，并且证实玉屏风散总多糖佐剂是新城疫疫苗的良好佐剂，其能显著改善新城疫疫苗的免疫效果。

技术领域

本发明涉及玉屏风散总多糖佐剂技术领域，更具体地，涉及一种玉屏风散总多糖佐剂的制备及其在新城疫疫苗中的应用。

背景技术

新城疫病毒属于分子负链RNA目、副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒属。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。

而目前，对新城疫病的免疫防治主要是以预防接种为主。接种用的疫苗有两大类，一类为灭活疫苗，另一类为弱毒苗。但是由于生物体有着极其复杂的免疫应答系统，单纯的疫苗接种往往效果不是很理想，各种因素均会影响疫苗的预防效果。

中药是我国的宝贵遗产，与合成药相比，具有不良反应少、毒副作用低、多效性、无依懒性等特点，并对机体具有显著的免疫调节作用，加之在使用安全性方面的优势，已经成为疫苗佐剂研究的一个热点方向。

发明内容

针对上述现状，本发明提供了一种玉屏风散总多糖佐剂的制备及其在新城疫疫苗中的应用。经证明，所述佐剂可显著改善新城疫疫苗的免疫效果。

具体而言，本发明首先是提供了一种玉屏风散总多糖佐剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1）分别称取黄芪、白术、防风三味药材，将上述新城疫疫苗药材放置于50℃烘箱内进行烘干处理，分别粉碎后过 20目筛备用；

2）将上述药粉按一定的质量配比配置成玉屏风散，并将其置于圆底烧瓶，以100mL石油醚超声 30min，药渣滤过后挥干备用；

3）将玉屏风散按一定的料液比置于相应量去离子水中浸泡1h，然后采用水浴中回流提取，提取后，进行抽滤和浓缩提取液，采用无水乙醇沉淀浓缩12h，取沉淀物进行真空干燥，即可得到玉屏风散总多糖。

优选地，本发明提供的黄芪、白术、防风三味药材的质量配比为1 :1 :1、1 :2 :1或1 :1 :2；

进一步地，本发明提供的黄芪、白术、防风三味药材的质量配比为1 :2 :1；

优选地，本发明制备方法中的液料比为1:10、1:15、1:20；

进一步地，本发明还提供了新城疫疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1）以新城疫疫苗的HN（hemagglutinin-neuraminidase）氨基酸序列作为制备新城疫亚单位疫苗靶标区域；

2）采用PCR方法扩增获得HN的部分基因序列，将其扩增产物进行分离纯化；

3）将纯化后的产物与载体连接，连接后将重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞中进行扩繁；

4）经抗性筛选，将鉴定为重组质粒的大肠杆菌进行蛋白提取，经浓缩沉淀后，即可得到新城疫HN亚单位疫苗。

优选地，本发明所述新城疫疫苗的制备方法中采用的扩增上下游引物序列分比为5'-cagcacgactctgttaaccg-3'、5'-cgaacaatagcggatgtggg-3'；

优选地，本发明所述新城疫疫苗的制备方法中的载体为pGEMT-TEaey载体；

优选地，本发明所述新城疫疫苗的制备方法中的大肠杆菌为JM-109大肠杆菌；

进一步地，本发明还提供了一种新城疫疫苗，所述疫苗包括新城疫亚单位疫苗和玉屏风散总多糖佐剂；

优选地，所述新城疫疫苗中新城疫亚单位疫苗和玉屏风散总多糖佐剂的用量配比为1μg：4mg。

进一步地，本发明还提供了所述的玉屏风散总多糖佐剂在制备新城疫疫苗中的用途。

优选地，所述新城疫疫苗包括新城疫亚单位疫苗。