[发明专利]大队列样本单细胞富集和混样建库测序方法

说明书

本发明公开一种大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，包括如下步骤：S1、形成多来源的单细胞样品；S2、对不同来源的单细胞样品分别进行生物素抗体孵育、链霉亲和素偶联寡核苷酸标记，然后多样品混合形成混合样品；S3、制备3’转录组cDNA样品和标记DNA样品；S4、构建3’转录组文库；S5、构建标记DNA文库；S6、将3’转录组文库和标记DNA文库合并进行测序分析。本发明提供的单细胞富集、链霉亲和素偶联寡核苷酸标记样品、单细胞转录组混样建库测序及分析的技术方法，适用于感染性疾病、炎症、肿瘤等大队列样本研究和稀有细胞群体研究。

技术领域

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种大队列样本单细胞富集、亲和素抗体孵育、链霉亲和素偶联寡核苷酸标记样品、单细胞转录组混样建库测序及分析的方法。

背景技术

转录组测序(RNASequencing,RNA-seq)是指对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，既可以检测基因表达水平差异、提供定量分析，又可以提供结构分析，识别可变剪切位点、基因融合等，而且不依赖于参考基因组。传统转录组测序(BulkRNASequencing,BulkRNA-seq)测量一个大的细胞群体中每一个基因的平均表达水平，对于基因表达的本质研究不够深入，很多基因表达的时空信息被掩盖、也不能反映组织细胞间的异质性(LiX,WangCY.Frombulk,single-cellto spatial RNAsequencing[J].IntJOral Sci,2021,13(1):36)。

近年来，单细胞转录组测序技术(single-cellRNA-seq，scRNA-seq)得到了蓬勃的发展，可在单细胞水平揭示基因表达差异。scRNA-seq应用于各类物种(特别是人、小鼠等)的不同类型组织细胞和细胞系，包括正常和病变细胞等(Kuksin M,Morel D,AglaveM.Applications of single-cell and bulk RNA sequencing in onco-immunology[J].EurJCancer,2021,149:193-210)。scRNA-seq能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用(Paik DT,Cho S,Tian L,Chang HY,Wu JC[J].Single-cell RNA sequencing incardiovasculardevelopment,disease andmedicine.NatRevCardiol,2020,17(8):457-473)。

根据测序捕获的转录本序列范围，scRNA-seq主要可分为以Smart-seq2为代表的转录组全长测序技术，以及以10X Genomics为代表的3’/5’转录组测序技术。前者将cDNA打断后，对转录本的所有片段测序。优势是基因检出数较后者高、可以检测转录本的全长信息，缺点是细胞通量较低、单个细胞的测序成本高、而且检测的不是真实的全长转录本。10XGenomics使用Barcoding(条形码)和Microfluidics(微流体)技术，在单细胞分离、扩增原理上具有优势，可捕获的细胞通量高，但测序成本非常昂贵。(Kashima Y,Sakamoto Y,Kaneko K.Single-cell sequencing techniques from individual to multiomicsanalyses[J].ExpMolMed,2020,52:1419-1427；ViethB,Parekh S,ZiegenhainC.Asystematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines[J].NatCommun,2019,10(1):4667；Wang X,He Y,Zhang Q,Ren X,Zhang Z.Direct comparativeanalyses of 10X Genomics chromium and Smart-seq2[J].Genom Proteom Bioinf,2021,19(2):253-266)

综合来说，当前单细胞制备和scRNA-seq建库测序中存在以下缺陷：