[发明专利]诱导神经元分化的RNA组合物、分化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导神经元分化的RNA组合物，包括修饰后的mRNA和MicroRNA组合物；本发明还提供了利用上述RNA组合物诱导皮层谷氨酸能神经元分化的方法，通过瞬时过表达mRNA和MicroRNA组合物，可将多能干细胞在七天内诱导分化为神经元；本发明还提供了上述RNA组合物的应用，用于诱导皮层谷氨酸能神经元分化。本发明通过优化转染过程及mRNA递送系统，显著提高了转染mRNA的翻译效率和mRNA在细胞中的表达量。本发明适用于诱导皮层谷氨酸能神经元分化，分化后的皮层谷氨酸能神经元可进一步应用于人神经相关疾病病理模型的构建。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，涉及神经元分化方法，具体地说是一种诱导皮层谷氨酸能神经元分化的RNA组合物mod-mRNA 3FM、方法及其应用。

背景技术

近年来，干细胞技术迅速发展，是发育研究、疾病建模和再生医学的研究基础，为人类疾病的研究开辟了新的方向。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs），包括胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），均具有向神经元分化的潜力。hPSCs定向分化技术为神经退行性疾病的研究提供了更真实的病理生理模型，分化神经细胞移植为神经疾病的治疗提供了新的思路。

现有的分化方案试图模拟发育生物学的分化过程，多依赖于对发育过程中已知信号的调控，如小分子等对Wnt、Hedgehog信号通路的调控，这一分化方法对细胞命运的调控不够精确，存在分化时间过长、分化过程繁琐的问题。另一种分化方法是通过激活转录因子（transcription factors, TFs）进行诱导分化，TFs诱导可以在不同的细胞系间诱导分化细胞，TFs诱导分化一方面可以缩短细胞分化的时间，另一方面可以精确调控细胞命运分化。通过人类TFome的大规模筛选，TFs直接靶向潜在的下游相关效应因子，驱动细胞命运的改变，为细胞工程构建提供了基于TFs的诱导分化策略。

目前大多数研究都是借助病毒、质粒和其他载体过表达实现TFs诱导分化，然而这些方法都是基于DNA过表达的递送技术进行的，具有外来基因整合到基因组中的风险。与此相比，基于mRNA过表达的技术不会整合到基因组中，不会带来插入突变的风险。然而，众所周知，传统的mRNA稳定性差且具有很强的免疫原性，很大程度上限制了mRNA技术的发展。化学修饰的mRNA很大程度上可以降低mRNA引起的免疫反应。通过体外合成与细胞自身mRNA结构类似的IVT mRNA，将其递送至细胞中发挥作用。因此，最近在mRNA合成及修饰方面的进展使得修饰mRNA (mod-mRNA)成为有前途的细胞重编程的方法。基于mod-mRNA系统过表达TFs具有快速、瞬时、高效、剂量可控的蛋白表达，为细胞命运调控与分化提供了更理想的方法。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种诱导皮层谷氨酸能神经元分化的RNA组合物mod-mRNA 3FM，以实现快速高效地诱导皮层谷氨酸能神经元分化，获得具有电生理功能成熟的皮层谷氨酸能神经元；

本发明的另一个目的，是要提供一种利用上述RNA组合物mod-mRNA 3FM诱导皮层谷氨酸能神经元分化的方法，通过优化转染过程及mRNA递送系统，达到提高转染mRNA的翻译效率，显著提高mRNA在细胞中的表达量的目的；

本发明还有一个目的，是要提供上述RNA组合物的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种诱导神经元分化的RNA组合物，它包括修饰后的mRNA和MicroRNA组合物。

作为一种限定，所述mRNA为编码NEUROG1蛋白、 NEUROG2蛋白和 NEUROD1蛋白的mRNA。

作为另一种限定，所述修饰方法为CleanCap AG加帽和poly-A加尾。

作为第三种限定，所述MicroRNA组合物包括miR-9和miR-124。