[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用

说明书

本发明主要利用定点突变技术构建来源于特异腐质霉的β‑葡萄糖苷酶的突变体菌株，获得了一种葡萄糖耐受能力提高的β‑葡萄糖苷酶突变体A354P，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。相同条件下，突变体A354P的比活力为36.71U/mg，较野生型提高了40.28％；而且突变体A354P可在600mmol/L葡萄糖的激活下最高达到190.29％的相对活力，相比野生型具有显著提高的葡萄糖耐受能力；突变体A354P对于虎杖苷也具有更强的水解能力。本发明中的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidases EC 3.2.1.21)，全称β-D-葡萄糖苷水解酶，属水解酶类，又称纤维二糖酶、龙胆二糖酶或苦杏仁苷酶。该酶可以水解结合于末端的非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖以及相应的配基。β- 葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有水解活性，可作用于多种生物活性物质，其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分；有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，可转化生成功能性低聚糖，因此在食品保健，生物能源等领域具有广阔的应用前景。

近年来能源问题日益严峻，新型能源的开发至关重要，生物能源由于其来源广泛、可再生等优势已成为研究者的关注重点，被认为是未来能源的首选，对其进行研究开发已成为全球发展趋势。全球每年有约2千亿吨的光合作用的有机物产生，其中约有60％以上是木质纤维素。并且我国作为农业生产大国，有十分丰富的木质纤维素资源可以被利用。而纤维素是自然界中来源最广、含量最多的植物多糖。从结构上来说，其基本重复单元为纤维二糖，是 D-葡萄糖单体分子以β-1,4-糖苷键连接起来的线性多糖化合物。但是天然纤维素中，结晶区的纤维素结构紧致，不容易被分解，就使得天然纤维素水解较为困难。而酶解法降解纤维素，过程简单，成本低，基本不会存在环境污染问题。研究表明，β-葡萄糖苷酶是整个纤维素水解过程中的限速酶，在酶解法降解纤维素过程中其关键作用，因此提高β-葡萄糖苷酶酶活在生物能源领域具有重要意义。

同时，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶因其可降低葡萄糖对酶活力的抑制作用，而显示出独特的应用潜能。CN102220302A以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过PCR定点突变，获得突变基因，相对野生型β- 葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了13倍。 CN103266096A通过将β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的386位的色氨酸突变成半胱氨酸，得到β-葡萄糖苷酶突变体Pbgl-W386C，葡萄糖的耐受性是突变前的11.88 倍，提高了10.88倍。CN105754973A通过将链霉菌的β-葡萄糖苷酶S-bgl6分子上的233位色氨酸突变成天冬氨酸而得到β-葡萄糖苷酶突变体，和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。CN107142254A将来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillussp.A4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，得到较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，在相同条件下，葡萄糖对突变体和野生型的酶活促进作用分别为212％和163％。

发明内容

针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是通过定点突变技术构建一种酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

第二方面，本发明提供编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。

第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。

第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。