[发明专利]一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法

说明书

本发明提供了一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，该方法包括：对透明质酸进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸；测定所述荧光标记的透明质酸的标记度；用所述荧光标记的透明质酸孵育细胞，孵育一定时间后，通过超分辨显微镜观察透明质酸是否进入细胞的内部，并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。本发明实现了对透明质酸透细胞膜吸收能力的可视化及定量分析，更加直观、准确。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是天然存在的一种由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位交替连接而成的糖胺多糖，是细胞外基质的主要成分之一。HA在自然界中普遍存在，其在不同的生物中、同一种生物不同的组织中均有分布，且在生物体内发挥着重要而又丰富的作用，比如HA可以调节细胞的增殖、粘附、迁移，调节机体的炎症反应、增强免疫应答等作用。细胞表面有很多对透明质酸起到识别作用的受体，如TLR2/4，CD44以及RHAMM等，其中CD44被认为是细胞表面与透明质酸识别相关的受体，有研究表明透明质酸在细胞表面被CD44受体识别并结合后被细胞通过胞吞作用吸收入细胞内。而在细胞内，除了有通过胞吞作用被吞噬入细胞内的透明质酸外，还存在大量的内源性透明质酸，且透明质酸分子本身不带荧光，不同分子量的透明质酸混合后难以区分，所以在研究细胞对透明质酸的摄取时，如何将进入细胞内的透明质酸分子与细胞内的其它成分分离并进行鉴定存在较多的困难。

目前有研究通过异硫氰酸荧光素(FITC)对透明质酸进行标记并以普通荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞进行观察，以确认透明质酸分子是否进入到了细胞内，但FITC分子本身无法与透明质酸直接结合，需要通过乙二胺等物质作为桥连接透明质酸与FITC分子，这样需要通过两步反应，反应的交联度低，且在水溶液中虽通过EDC/NHS作为交联剂，但连接效率仍极低。除此之外，不管是普通的荧光显微镜还是共聚焦显微镜，其较低的分辨率导致其难以对细胞内的荧光强度进行精准的定量。

有鉴于此，仍需要研究便于精准定量分析透明质酸分子进入细胞内的情况的方法，特提出本申请。

发明内容

本发明针对透明质酸分子本身不带荧光无法直接进行观察、进入细胞内的透明质酸难以鉴别和定量分析，现有技术缺乏评估透明质酸进入细胞能力的有效方法的问题，提出一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法。

本发明方法通过对透明质酸分子进行荧光标记，并使用超分辨显微成像技术对带有荧光标记的透明质酸分子穿过细胞膜进入细胞内的行为进行观察，通过图像处理软件分析细胞内荧光强度的高低以分析不同透明质酸样品透细胞膜吸收能力。

本发明的主要技术构思如下：

一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，包括如下步骤：

对透明质酸进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸；

测定所述荧光标记的透明质酸的标记度；

用所述荧光标记的透明质酸孵育细胞，待孵育一定时间后，通过超分辨显微镜观察透明质酸是否进入细胞的内部并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。

超分辨显微镜，或称超高分辨显微成像技术，其采用的结构光照明显微成像技术(SIM)的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨的信息。SIM技术由于其具有光毒性低、成像速度快、可用于观察活细胞等优点而得到了越来越广泛的应用。其优点在于对荧光探针的要求较低，样品制备过程相对简单。此外，在使用超分辨显微镜的实验中可以很好地实现多色成像和活细胞成像，因此可用其较精确地分析荧光标记的透明质酸在细胞内的分布情况。