[发明专利]一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物

权利要求书

1.一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物，其特征是：所述辣木籽提取物命名为Moringa A，其化学结构为：

2.根据权利要求1所述的一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物，其特征是：所述辣木籽提取物Moringa A是从辣木籽甲醇提取物-丙酮萃取相中获得。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物，其特征是：所述辣木籽提取物Moringa A的制备方法：30kg干燥辣木籽粉碎至细粉，用甲醇回流提取2次，每次2h；合并滤液后用布氏漏斗抽滤合并，减压回收甲醇，烘箱干燥后得辣木籽粗提物；将所得粗提物用甲醇溶解后与10倍量80-100目硅胶进行拌样，减压旋干成粉末，经硅胶柱层析(80-100目)，将不同极性成分分开，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5种溶剂洗脱；收集丙酮洗脱液，减压回收丙酮，得丙酮洗脱部位Fr.D；Fr.D经硅胶柱层析(1:100上样)，用氯仿-甲醇-水(7:3:0.5)于冷库(4℃)洗脱，可得30个流分；取第11个流分，经硅胶柱色谱(200-300目)、Sephadex LH-20柱色谱、反相键合相色谱(ODS)以及制备型高效液相(HPLC)等分离手段进行分离纯化。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物抗病毒活性的测试方法，其特征是，包括以下步骤：步骤一、选定测试仪器，选定胎牛血清、DMEM高糖培养基、0.25％Trypsin-EDTA、双抗、DMSO、CCK-8和1％豚鼠红细胞为测试试剂，制备测试药物MoringaA，选定测试细胞为Raw264.7和MDCK细胞，选定测试病毒株为Influenza A/Weiss/43(PR8,H1N1)；步骤二、药物配制，精密称取步骤一制备的MoringaA约10mg，用无血清DMEM培养基配制成100μM浓度的溶液，4℃冰箱保存待用；步骤三、将冻存的Raw264.7细胞进行复苏，将RAW264.7巨噬细胞加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，置于95％湿度、5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，取传代的细胞，弃掉培养基，终止培养，经处理后在显微镜下(100×)计数四角大方格内的细胞总数，倒置显微镜下观察细胞，处于对数生长期且状态良好时将细胞冻存；步骤四、病毒扩增，采用MDCK细胞为宿主对H1N1病毒进行扩增；步骤五、RAW264.7细胞接种及加样，细胞存活率检测；步骤六、MoringaA体外抗H1N1活性测试。

5.根据权利要求4所述的一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物抗病毒活性的测试方法，其特征是：所述步骤五，取生长状态良好的RAW264.7细胞，消化后加10％FBS的无酚红DMEM高糖培养基制成细胞悬液，稀释细胞浓度至1×105个/mL，接种到96孔培养板，每孔150μL，置于37℃、5％CO2的孵箱中培养；24h后，移去上清液，受试药物组分别加入含有1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM、256μM、512μM的含MoringaA培养基；溶剂组为5‰的DMSO；同时设置空白对照组；以上各组细胞各设置3个复孔，在37℃、5％CO2的条件下继续培养24h；MoringaA孵育细胞24h后，向各实验组细胞中加入10ml CCK-8溶液，在培养箱中反应4h，反应结束后于450nm波长处测定各实验组细胞吸光度值，计算细胞存活率。

6.根据权利要求4所述的一种具有抗流感病毒活性的辣木籽提取物抗病毒活性的测试方法，其特征是：所述步骤六包括(1)取生长状态良好的RAW264.7细胞，消化后加含10％胎牛血清的RPMI1640培养基制成细胞悬液，并稀释细胞浓度至1×105个/mL接种到96孔培养板，每孔150μL，置于37℃、5％CO2的孵箱中培养；24h后，移除培养板中各孔上清液，加入新鲜RPMI1640完全培养基，同时向各培养孔中接种10μL H1N1病毒液，对照组加入等体积培养基，继续培养24h；(2)按授试药物将细胞分为正常组(control)、病毒组(virus)、奥司他韦组(OST)、MoringA(MA)高、中、低剂量组，给药剂量分别为10、5、1μM，每组6个复孔；移除各实验组细胞上清液，按受试药物相应加入含药培养基；H1N1组和空白对照组加入等体积培养基，然后在37℃、5％CO2的条件下继续培养24h；(3)24h后，将各实验组培养上清液对应收集于U型96孔板，每孔收集50μL；然后向U型96孔板中加入50μL1％的豚鼠红细胞，测定各实验组凝血滴度(Hemagglutination，HA)，结果以HA/50μL计。