[发明专利]基于闭合双极电极的双色电致变色传感器及其应用

说明书

本发明提出了一种基于闭合双极电极的双色电致变色传感器，其组成包括连接有铜绿假单胞菌特异性适配体的磁珠、ITO双极电极、电致发光溶液和普鲁士蓝沉积液。将上述双色电致变色传感器应用于快速检检测铜绿假单胞菌，利用闭合双极电极阴极和阳极的物理分隔优势，避免了PB与Ru(bpy)₃²⁺之间的相互干扰，从而极大地提高了本传感器的准确性和灵敏度，并实现了可视化检测和多色电致变色检测，本传感器能够在0~10⁸ CFU mL^‑1内灵敏检测铜绿假单胞菌，检测限低至1 CFU mL^‑1，同时能够有效避免出现假阳性结果。本发明将磁分离技术、双极电极、电致发光和电致变色结合方法为铜绿假单胞菌的可视化检测提供了一条准确、快速的途径，在食品检测中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于闭合双极电极的双色电致变色传感器及其在快速检检测铜绿假单胞菌上的应用。

背景技术

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种分布广泛的条件致病性革兰氏阴性菌，其适应性强，耐抗生素，可以在人、动物和环境中循环传播，严重影响着人类健康，因此研究一种快速检测铜绿假单胞菌的方法具有重要意义。平板菌落计数法是通用的检测细菌的“金标准”，但是其耗时较长，平均需要4-5天才能获得检测结果。其他细菌检测方法如聚合酶链式反应(PCR)、生物传感器、酶联免疫吸附(ELISA)等，虽然具有较高等的灵敏度和特异性，但是需要专业的操作人员、复杂的操作或者昂贵精密的仪器，这极大地限制了细菌快速检测的应用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于闭合双极电极的双色电致变色传感器，用于实现铜绿假单胞菌的快速可视化检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于闭合双极电极的双色电致变色传感器，包括连接有铜绿假单胞菌特异性适配体(PA aptamer)的磁珠(MBs)、ITO双极电极(BPE)、电致发光溶液和普鲁士蓝沉积液。ITO双极电极(BPE)为闭合双极电极，闭合双极电极可以将电化学信号转化为光信号，易于读出的同时降低了数据的处理难度；此外，阴极和阳极之间的反应是互不干扰的。

所述连接有铜绿假单胞菌特异性适配体的磁珠的制备方法如下：活化磁珠，将铜绿假单胞菌特异性适配体加入活化后的磁珠中，在20-25℃、200-300r/min下孵育，优选地，孵育时间为1-2h。弃上清，洗涤，然后加入BSA和缓冲液封闭未连接铜绿假单胞菌适配体的羧基，得到连接有铜绿假单胞菌特异性适配体的磁珠。其中，所述活化后的磁珠为羧基化磁珠。

优选地，所述铜绿假单胞菌的特异性适配体(PA aptamer)的核苷酸序列为：5’-TTT TTC CCC CGT TGC TTT CGC TTT TCC TTT CGC TTT TGT TCG TTT CGT CCC TGC TTCCTT TCT TG-3’，可购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；磁珠优选为羧基磁珠，可购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，粒径范围在0.3μm左右，货号为D110541-0500。磁珠活化液选用活化液25mM NHS和25mM EDC。

在一个具体的实施方式中，通过如下方法制备：首先，活化磁珠(MBs)，吸取10 μLMBs至2mLEP管中，用90μL PBS洗涤2～3次后，加入100μL活化液(25mM NHS和25mM EDC)，25℃300r/min，孵育1～2h；然后，用移液枪吸掉活化液，PBS 洗涤2～3次，添加1μL铜绿假单胞菌适配体(PA aptamer)，89μL PBS，25℃300r/min，孵育1h；最后，弃上清，PBS洗涤2～3次，加入10μL BSA和90μL PBS封闭未连接PA aptamer的羧基。BSA终浓度为2μg mL^-1。每一个步骤完成后需用90μL PBS清洗磁珠2～3次。