[发明专利]大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用，属于合成生物领域基因工程改造技术领域。与野生型的CBDAS相比，应用本发明所提供的CBDAS点突变体生产CBDA时，CBDA的产量均有不同幅度的提高，其中，C446A突变体所对应的CBDA产量提高了91.3%，达123 mg/L。

技术领域

本发明涉及大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用，属于合成生物领域基因工程改造技术领域。

背景技术

CBDA化学名称为2,4-dihydroxy-3-[(1R,6R)-3-methyl-6-prop-1-en-2-ylcyclohex-2-en-1-yl]-6-pentylbenzoic acid，分子式为C₂₂H₃₀O₄，CAS号为1244-58-2。

大麻二酚(Cannabidiol, CBD)是大麻植物的次生代谢物，是由CBDA经脱羧获得。研究发现CBD具有抗肿瘤、神经保护、代谢和免疫调节、抗炎抗氧化、保护心血管和护肝等功效，2008年FAD批准了首个工业大麻植物来源的CBD处方药Epidiolex，用于治疗两种非常严重且罕见的婴儿癫痫病Dravet综合征和Lennox-Gastut综合症。在传统的工业生产中，CBD主要是通过提取大麻植物的前体CBDA，然后经过加热脱羧后得到CBD。该方法存在周期长、效率低、成本高、环境不友好和可能含有致幻成分四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）等缺点。因此，采用合成生物学技术实现以廉价原材料在短周期内高效合成CBDA十分必要。

CBDA在大麻（Cannabissativa）植物里由CBDAS（Cannabidiolic acid synthase，大麻二酚酸合成酶）以FAD为辅因子，通过对底物大麻萜酚酸 (Cannabinol acid，CBGA)进行环化而得，同时消耗一份子O₂，产生一份子H₂O₂。CBGA作为多种大麻素合成的前体，可被多种酶，包括CBDAS和四氢大麻酚酸合成酶（Tetrahydrocannabinolic acid synthase，THCAS）作为底物，分别合成CBDA和四氢大麻酚酸（tetrahydrocannabinolic acid，THCA）。据报道，这两个酶最初在大麻被鉴定，且两种酶在大麻里的酶活性相似。后来研究者们尝试把它们表达在不同的物种里，包括Pichia pastoris，昆虫细胞Spodopterafrugiperda，烟草Tobacco和Komagataellaphaffii，与THCAS不同的是，仅在P. pastoris和K.phaffii可检测到CBDAS活性。Xiaozhou Luo等首次在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞中从头合成多种大麻素，结果显示，CBDA的产量与THCA相差500倍以上。综上，尽管在大麻植物里，CBDAS和THCAS的酶活性相似，但CBDAS在其他物种体内表达相对THCAS较难，产量也低，这给工业化生物合成CBDA带来困难，故需要改造出产量更高的CBDAS酶，从而提高生产经济效益。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是野生型的CBDAS在酿酒酵母中直接表达时活性低，相应地，CBDA产量也低，这给工业化生物合成CBDA带来困难。

[技术方案]

本发明利用定点突变对CBDAS进行改造，得到多个活性提高的CBDAS突变体。本发明利用酿酒酵母表达得到了这些活性提高的CBDAS突变体，这些突变体可在酵母胞内合成CBDA，且CBDA的产量得到了提高。