[发明专利]基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用

说明书

本发明公开了水稻Wx突变型蛋白、突变型基因及其应用，本发明还公开利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法。本发明首次利用基因编辑技术，对Wx基因进行单碱基编辑，通过后代的筛选，在T₂代就可以获得剔除T‑DNA的、外观透明、直链淀粉含量适当降低且品质得到改良、能稳定遗传的新材料。相对于化学诱变、杂交转育等育种，基因编辑定向改良分子育种技术具有快速、精准、高效等优点，结合基因功能标记基因型选择，或者直接利用其他成熟水稻品种为背景材料进行转化并获得相应材料，将会极大提高育种效率，大大加快育种进程。

技术领域

本发明属于作物遗传育种、作物品质改良新资源创新、优良食味作物育种领域，具体涉及基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是中国乃至世界范围内的重要粮食作物，对保障粮食安全具有举足轻重的作用。

稻米品质是指稻米在商品流通中所必须具备的基本特征，包括碾磨品质、外观品质、蒸煮与食味品质和营养品质等四个主要方面，其中以外观品质和蒸煮与食味品质尤为重要。种子胚乳是稻米主的要食用部分，从化学成分上分析，构成胚乳的主要成分是淀粉，一般占胚乳干重的90％，甚至更多，因此，稻米的蒸煮食味品质很大程度上取决于淀粉的理化特性，参与水稻胚乳淀粉合成及调控的基因在稻米品质形成的过程中扮演了极其重要的角色。经过科研工作者大量的研究，人们对稻米蒸煮与食味品质性状的遗传基础已有了较为深入的了解，水稻胚乳淀粉合成的途径、参与的基因或酶己经得到了详细的阐明。其中，参与淀粉合成的酶主要包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶等。

构成稻米的淀粉主要有两类，即直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)。直链淀粉是α-1，4-糖苷键连接而成的葡萄糖聚合体，它是一种线性大分子，没有或很少有分支。一般认为，直链淀粉含量(Amylose Content，AC)是稻米蒸煮、加工以及食用品质的决定因素。水稻Wx基因编码颗粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量。该基因于 1990年被克隆，位于第6染色体的短臂，一般粳型品种中该基因由14个外显子和13 个内含子组成，编码由609个氨基酸组成的蛋白。该基因的不同等位变异决定了稻米的直链淀粉含量，截至目前至少有8个已发表的Wx等位基因。在糯稻中，Wx由于第2 外显子23bp的缺失造成了转录提前终止。在非糯品种中，Wx主要分化为Wx-a和Wx-b 两种等位类型。其中，携带Wx-a的稻米直链淀粉含量都在25％以上，属于高直链淀粉类型。Wx-b主要分布在粳稻品种中，携带该基因稻米的直链淀粉含量属中等至较低水平(15％～18％)，与Wx-a相比，Wx-b的变异是由第一内含子剪接位点处G-T变异造成的，突变降低了前体mRNA的剪接效率从而导致稻米中的直链淀粉含量降低。此外，研究人员还克隆了Wx-in等位基因，证明在第6外显子上发生A-C变异可导致直链淀粉含量降至中等水平(18％～22％)。此外，还有3个“软米基因”即Wx-mq、Wx-mp和 Wx-op相继被克隆(所谓的软米，即指的的稻米AC在8％～12％之间，米饭表面光泽透亮、质地柔软、富有弹性、冷饭不硬、食味品质极佳的稻米)，与Wx-b相比，Wx-mq 在第4(氨基酸序列第158位精氨酸突变为组氨酸)和第5(氨基酸序列第191位络氨酸突变为组氨酸)外显子处存在2处突变，导致直链淀粉含量降到10％左右。另一等位基因Wx-mp在第4外显子发生突变(氨基酸序列第158位精氨酸突变为组氨酸)，位置与Wx-mq相同，第5外显子没有突变，携带该等位基因的稻米直链淀粉含量也在10％左右，另一个软米基因为Wx-op与来源于云南毫屁的Wx-hp，都是由第4外显子的A-G 突变造成的(氨基酸序列第165位天冬氨酸突变为甘氨酸)，前人以根癌土壤杆菌糖原合酶为模型，绘制了Wx-hp的三维结构图，推测突变位于淀粉合成酶催化域，导致淀粉合成能力下降。综上，我们认为人为突变(如利用基因编辑技术)Wx基因编码的淀粉合成酶核心催化域的单个氨基酸，尤其是在3-D模型中与第33-36位(Lys-Ser-Gly-Gly) 氨基酸残基相邻的相关氨基酸(据报道此33-36氨基酸残基的位点是淀粉及糖原合成时与ADP-葡萄糖的结合位)，可能能创制新的突变类型，为满足当前市场对稻米品质的更高要求提供材料支持。