[发明专利]一种构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法及其应用。本发明获得的突变株ΔKu80可将嗜热毁丝霉CRISPR‑Cas9基因编辑系统的同源重组效率由野生型的57%，提高至86%，减少嗜热毁丝霉遗传转化的工作量提高同源重组效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法及其应用。

背景技术

嗜热毁丝霉是一种能够快速降解纤维素的嗜热丝状子囊真菌，具有较高的纤维素酶表达分泌能力。与工业纤维素酶生产丝状真菌里氏木霉和斜卧青霉相比，嗜热毁丝霉所产的酶活力高、热稳定性强，在工业生产中具有广阔的应用前景。同时，嗜热毁丝霉产生的聚糖结构与大多数其它非哺乳动物生产宿主相比更类似于人类聚糖形式，在医药领域中表现出巨大的应用潜力。因此，通过基因工程改造开发嗜热毁丝霉成为新型的丝状真菌底盘细胞，对工业纤维素酶、治疗性蛋白质、疫苗以及初级和次级代谢物的生产具有重要的意义。

目前，丝状真菌遗传体系和基因组编辑技术发展相对较慢，其极低的遗传转化效率和同源重组效率，严重制约了丝状真菌用作于底盘细胞，妨碍了丝状真菌的基础研究与开发利用。在丝状真菌中，DNA双链断裂主要通过非同源末端连接和同源重组两种机制来修复，但是在丝状真菌中非同源末端连接效率往往显著高于同源重组效率，外源DNA多以随机插入的方式整合到基因组染色体中，造成筛选工作量大，定点敲除效率低，进而对相关功能基因研究与菌株基因工程靶向改造产生了极为不利的影响。因而，构建一种具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株在其基因工程改造中具有很大的应用前景和实用性。

近年来，尽管一些研究报道缺失非同源末端连接途径上关键基因可以提高同源重组效率，但是缺失相同功能基因在不同真核宿主细胞间却存在截然不同的效果，比如缺失Ku70的酿酒酵母菌株具有增加DNA序列向其基因组定点整合效率的作用，而缺失Ku70的哺乳动物细胞针对靶基因定点整合的效率却没有提高。再者，考虑到丝状真菌的遗传转化效率较低，尚不明确敲除丝状真菌非同源末端连接途径上关键基因是否会间接影响其遗传转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法。

本发明的再一目的是提供一种提高嗜热毁丝霉CRISPR-Cas9基因编辑系统的同源重组效率的方法。

根据本发明的构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法包括敲除嗜热毁丝霉的Ku80基因的步骤，所述Ku80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法包括以下步骤：

以嗜热毁丝霉为出发菌株制备原生质体；

制备Ku80基因敲除盒；

将敲除盒采用CRISPR-Cas9基因编辑系统导入原生质体，在培养基上进行培养和筛选。

根据本发明的构建具有高同源重组效率的嗜热毁丝霉菌株的方法，其中，所述嗜热毁丝霉为菌株ATCC4246。

一种提高嗜热毁丝霉CRISPR-Cas9基因编辑系统的同源重组效率的方法，所述方法包括以下步骤：

敲除嗜热毁丝霉的Ku80基因，所述Ku80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

制备缺失Ku80基因的嗜热毁丝霉菌株的原生质体；

将目的基因敲除盒、Cas9和sgRNA导入所述缺失Ku80基因的嗜热毁丝霉菌株的原生质体中，在含有抗生素的培养基上进行培养和筛选。

本发明具备如下有益效果：

本发明获得的突变株ΔKu80可将嗜热毁丝霉CRISPR-Cas9基因编辑系统的同源重组效率由野生型的57%，提高至86%，减少嗜热毁丝霉遗传转化的工作量提高同源重组效率。

附图说明