[发明专利]一种葱韭类蔬菜种子超低温保存方法

说明书

本发明属于种子保存技术领域，公开了一种葱韭类蔬菜种子超低温保存方法，包括取适量种子放入冻存管中；将冻存管投入液氮罐；对超低温处理后种子放入40℃人工培养箱中，经4h后取出进行复温(化冻)；将复温(化冻)后的种子进行发芽试验；将发芽的种子转移至含有基质的穴盘中培养。本发明的方法简易，可应用于葱韭类蔬菜种质的长久保存，可避免因常规保存活力降低造成种质资源丢失的风险；减少了常规保存中需要对活力低种质资源不断繁殖更新的人力和经济成本；种源的长久安全保存，将提高种质资源的利用效率；也可应用于商业化生产中葱韭类蔬菜种子的保存，特别是珍稀种源的安全保存。

技术领域

本发明属于种子保存技术领域，尤其涉及一种葱韭类蔬菜种子超低温保存方法。

背景技术

葱韭蔬菜主要包括韭菜、洋葱、韭葱、大葱等。富含糖分、维生素c以及硫、磷、铁等矿物质，并含有杀菌物质，有促进食欲、调味、去腥和医疗等作用，是重要的药菜兼用型特色蔬菜。

葱韭蔬菜类型多样，种质资源遗传多样性非常丰富，这些资源主要以种子的形式进行保存，服务于育种和产业发展。葱韭蔬菜种子属于短命种子，一般常温下，1-2年其活力会明显下降。因此，保存这些资源主要在低温种质库中进行保存。然而研究发现，在低温保存中保存这些种质资源并不理想，3-5年后均有明显下降，严重影响种子的发芽率。在实际实施中，种质资源保存库不得不耗费大量的人力物力不断监测这些资源的活力，并每隔2-5年就要对这些资源进行更新复壮。如何长久安全保存这些国家战略资源，面临巨大挑战。因此，研究一种可以长久安全保存这些种质资源的方法具有重大意义。

超低温保存作为离体保存技术的重要组成部分，具有环保，节约成本，方便等众多优点，是植物种质资源长期保存的理想方法。超低温保存技术是目前长期有效保存种质资源的方法，是指在-80℃以下的超低温中保存种植资源的生物学技术，其中液氮最为常用，是-196℃(液氮)的超低温环境下，植物种子几乎所有活细胞的物质代谢和生长活动处于相对稳定的生物学状态。这种方法能够保持生物材料的遗传稳定性，而且也不会丧失其形态发生的潜能。超低温保存技术可以保存和抢救物种，能避免物种突变的发生，是长期稳定保存植物种资源以及珍贵实验材料的重要方法。液氮超低温保存技术从开始成功储存植物材料发展至今，已被公认为种质长期保存的最佳方法之一。植物种子在液氮超低温环境中会停止细胞新陈代谢，因而细胞活力和形态理论上可获得稳定保存。超低温保存早期大多使用冻结化保存技术，主要有直接冷冻法、分步冷冻法、玻璃化法、干燥冷冻法、包埋脱水法等。到目前为止，1922年H.E.Knowlton 将金鱼草花粉冷冻到-180℃后，仍获得一定程度的萌发率。这是超低温冷冻保存植物种质的最早报告。1956年日本科学家A.Sakai首次报道耐寒桑树枝经冷冻脱水后超低温保存能存活。1968年R.S.Quatrano报道亚麻培养细胞经(DMSO) 预处理后能够抗-50℃低温。1971年R.Latta报道胡萝卜悬浮细胞在液氮(-196℃)中保存成功，且再生出胚状体。1976年M.Seibert首次报道麝香石竹茎尖超低温保存成功，指出具有2～3对叶原基的效果最好，之后超低温保存技术在植物种质资源保存方面的研究逐渐深入，应用不断扩大。已有近千种植物成功进行了超低温保存，并且一些植物种质资源实现了规模化超低温保存；如苹果、桑树休眠芽和马铃薯茎尖。郑光植等人1983年成功地对药用植物的愈伤组织及其悬浮培养细胞进行了超低温保存，成为我国植物种质资源超低温保存研究的开创者。1989年，Uragami等及Langis等首次用玻璃化法成功地冻存了石刁柏体细胞胚和薄荷悬浮培养物。1992年，Niino等采用包埋干燥法保存5个苹果品种的离体茎尖得到了较高的存活率。在国内此项研究起步较晚，赵艳华等人在1998年用包埋干燥超低温技术保存苹果离体茎尖，获得了成功。研究还发现，2015年曾琳等人已对益智种子进行了液氮超低温保存实验探究，并已证明液氮超低温保存益智种子是可行的。2016宋红等人超低温冷冻后的玉蝉花种子可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)活性和菊花茎尖超氧化物歧化酶(SOD)活性降低了。尽管目前存在多种超低温保存植物材料的方法，但到目前为止仍没有一种可对所有植物材料进行保存的方法。因此，要对植物材料进行恰当的保存，必须根据材料的特点来选择合适的方法。