[发明专利]一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。具体技术方案为：一种嵌合加帽酶，由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。本发明构建了一种新的嵌合加帽酶，与野生型加帽酶例如牛痘病毒加帽酶相比，具有更高的蛋白表达量、更简单的纯化方式、更优的酶活性以及更优的热稳定性，因此具有更广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。

背景技术

真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用，并且可以降低其在细胞内的免疫原性。因此，在许多治疗应用中，为mRNA加帽非常重要。

加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鸟苷酰基转移酶活性（GTase）和鸟嘌呤甲基转移酶活性（MTase），可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7GpppN，即Cap0结构）。

目前mRNA的加帽途径主要有两种。第一是基于加帽酶的转录后修饰，此方法可以合成传统的帽子结构：m7GpppN（Cap0）、m7GpppNmpN（Cap1）和m7GpppNmpNm（Cap2）；由于帽子结构mRNA 5’端没有游离的末端磷酸基团，所以可降低mRNA降解的风险。同时Cap1、Cap2mRNA后面两个核苷酸上的甲基分别封闭了磷酸酯键上游离的2’OH基团，因而对RNA酶A、T1、T2都很稳定。第二是在体外转录过程中添加帽类似物，比如抗-反转帽类似物（ARCA）的帽类似物和加帽的二核苷酸，这种方法通常被称为“共转录加帽”。

共转录加帽的方法更为通用、简便和便宜，并且可以将各种修饰的帽结构进行多样化设计。但此方法中有部分竞争性帽类似物会导致mRNA不完全加帽，同时部分帽类似物会反向定位到mRNA的末端。因此，与共转录加帽相比，利用加帽酶进行加帽的收率更高。

目前主要使用的加帽酶为牛痘病毒加帽酶，其含有一个大亚基D1和一个小亚基D12。牛痘病毒加帽酶的表达纯化效率较低，导致其价格居高不下，限制了其工业化生产。除牛痘病毒加帽酶外，其他种属来源的加帽酶的加帽率只有其50～80%。

因此，业内亟需一种加帽效果更稳定、加帽率更高，更易规模化、工业化生产的加帽酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种嵌合加帽酶，由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。

优选的，所述其它单链加帽酶为非洲猪瘟病毒加帽酶、巨大病毒加帽酶或阿米巴病毒加帽酶中的任意一种。

优选的，所述其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒来源的pNP868R或阿米巴病毒来源的D5b。

相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示。

相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。

相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。

相应的，含有所述嵌合加帽酶的重组表达载体或重组细胞株。

相应的，所述嵌合加帽酶的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备所述嵌合加帽酶的重组表达载体；

（2）培养所述重组表达载体，得菌液；

（3）向所述菌液中加入IPTG，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；