[发明专利]运动发酵单胞菌内源性启动子突变体

说明书

本申请公开了运动发酵单胞菌内源性启动子突变体，所述启动子突变体引导可嵌合连接的异源核酸的表达，促进异源核酸的表达，同时这些启动子突变体是相对于野生型启动子具有显著增强功能的高表达启动子，用于在发运动发酵单胞菌属和/或埃希氏菌属细胞中表达嵌合基因。

技术领域

本申请涉及合成生物学和基因工程技术领域，尤其涉及运动发酵单胞菌内源性启动子突变体。

背景技术

合成生物学作为一门新兴的交叉学科，正在蓬勃发展中，在农业、工业、智能材料和生物医学等领域都有广泛的应用。合成生物学的基础是生物元件，充足且与底盘兼容的生物元件(包括启动子、终止子、核糖体结合位点和核糖开关等)是有效设计和组装基因线路，实现合成生物学工程化的关键。启动子作为核心生物元件，是转录起始所需的一段DNA序列，通常位于功能基因5'端上游，包含特异性结合RNA聚合酶和转录调节因子(如调节蛋白和small RNA)的保守序列。启动子的基因序列决定了下游基因的表达强度和表达模式(组成型或诱导型)，因此成为驱动基因表达、调节基因回路和获得高效细胞工厂的关键组成部分，现阶段可以通过不同强度的启动子实现靶基因高效和精准的表达和调控。

然而，随着对靶基因的高效表达和精准调控的要求不断提高，对启动子的强度和在不同底盘细胞中的兼容性的要求也不断提高，例如，往往当一个宿主内源性启动子在另一个宿主中使用时，启动子的强度通常会发生改变，从而影响下游基因的表达。

发明内容

运动发酵单胞菌是一种天然产乙醇的非模式菌株，是目前已知的唯一一种利用Entner-Doudoroff(ED)途径厌氧发酵的微生物。它具有许多作为工业底盘开发的优良特性，例如：快速高效的糖利用、高乙醇产量和耐受性、厌氧发酵副产物少、在酸性pH范围(pH4～8)内具有出色的发酵性能。此外，运动发酵单胞菌的基因组很小，包括内源性和外源性CRISPR-cas编辑系统在内的各种基因组工程工具已被开发；全基因组代谢网络模型的发展和积累的组学数据的可用性也使运动发酵单胞菌成为进一步发展的理想底盘。

在运动发酵单胞菌中，驱动编码参与糖酵解的酶基因表达的启动子(如Pgap、Ppdc、Peno和PadhB)通常是强启动子。其中，Pgap启动子是一个组成型串联启动子，驱动编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gap)基因的表达。它是运动发酵单胞菌中最强的启动子之一，长度为305bp，包含9个预测的转录起始位点(TSS)。通过生化手段已经鉴定出Pgap两个转录起始位点(TSS)，一个起始于胸腺嘧啶，另一个起始于腺嘌呤。近端启动子(Pgap 2)的-35区与远端启动子(Pgap1)的-10区具有重叠。Pgap在代谢工程中被广泛使用，已在运动发酵单胞菌、恶臭假单胞菌等多种菌株的功能回路中构建，以达到高产的目的。基于以上研究背景，本申请以运动发酵单胞菌内源启动子为基础，得到了一系列强启动子突变体，这些启动子不仅在运动发酵单胞菌中皆具有强启动子活性，而且在异源的大肠杆菌中亦具有强启动子活性，为提供一些强启动子和/或提高底盘细胞的兼容性提供了帮助。

第一方面，本申请实施例公开了包含运动发酵单胞菌内源性启动子突变体的核酸分子，其中，所述启动子突变体包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子突变体和ZMO1609基因启动子的至少一种，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子突变体是由甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子包括28位、30位、86位、107位、109位、136位、142位、164位和197位中的至少一处位置具有碱基取代形成的，或者为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的UP元件发生替代形成的；其中所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述ZMO1609基因启动子突变体是由ZMO1609基因启动子的UP元件发生替代形成的，其中所述ZMO1609基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本申请实施例中，所述碱基取代包括：28TA、30AG、86GT、107CT、109GC、109GA、136TC、142TA、164CT、197AT。

在本申请实施例中，其中所述UP元件是被来源于E.coli的UP元件进行1～2个替代。