[发明专利]一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法

说明书

本发明公开了一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法，具体为将食管鳞状细胞癌细胞株Eca109通过BTG2重组质粒转染后进行筛选，最终得到可稳定表达BTG抗增殖因子2的BTG2‑Eca109细胞株。能稳定表达BTG2蛋白的Eca109细胞株，可以为今后研究ESCC的基因诊断及靶向治疗提供有力的实验工具。BTG2蛋白作为一个抗细胞增值蛋白，参与到细胞内的很多生物学活动中，如细胞分化、增殖、凋亡等，同时也涉及到肿瘤治疗过程中的放疗敏感性。Eca109细胞株可以通过稳定表达BTG2基因，可用以研究食管鳞状细胞癌的放疗敏感性问题，从而为开发BTG2相关的癌症治疗提供新的思路。

技术领域

本发明涉及细胞株培养领域，特别涉及一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法。

背景技术

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，全球每年食管癌发病为57.2万人，死亡50.8万人。我国食管癌每年发病30.7万人，死亡28.3万人，在致死性肿瘤中排名第四，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占90%。虽然ESCC诊断和治疗在不断提高，但因其高侵袭及早转移的特性，很多患者发现时已是晚期，失去了手术机会，只能选择姑息治疗。放射治疗是一种重要的ESCC姑息治疗方式，但临床效果并不十分理想，五年存活率仅为10%~30%。影响放疗效果的原因很多，其中放疗抵抗依然是ESCC放疗的一个最大障碍，被认为是肿瘤局部复发或放疗失败的重要原因，严重影响食管癌患者预后。

B细胞易位基因2（B cell translocation gene 2，BTG2）隶属于BTG家族，由于该家族蛋白具有抗细胞增殖功能，因此也称为BTG抗增殖因子2（BTG anti-proliferationfactor 2）。目前的研究表明，BTG2是重要的抑癌和放射敏感基因p53的下游靶基因，作瞬时早期反应蛋白在多种组织或器官重表达，参与细胞分化、增殖、凋亡等多种生物学活动，被认为是喉癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种类型癌症的新型抑癌基因，更重要的是过表达BTG2可以亦可以提高乳腺癌细胞的放疗敏感性。但目前为止BTG2与ESCC发生发展及放疗敏感性关系的研究还未见报道。因此，亟需建立一种能稳定表达BTG2蛋白的细胞系，为今后研究ESCC的基因诊断及靶向治疗提共实验工具。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤：

S1. 细胞培养

将Eca109细胞株用DMEM培养基在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，每天观察并更换培养基一次。当细胞生长到汇合度达到75-85%时用0.2-0.3%的胰蛋白酶消化细胞进行传代。转染质粒前细胞需传代2-3次以保证细胞状态良好。

S2. 构建重组质粒

设计基因序列，在BTG2全长的基因组核酸序列5端引入EcoRⅤ酶切位点，3端引入XhoⅠ酶切位点，将得到的序列进行基因片段合成，将合成产物采用EcoRⅤ和XhoⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化，并在纯化产物中加入T4DNA连接酶与pcDNA3.0质粒（该质粒已采取EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切处理），在4℃连接15-17h，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，并将转化产物涂抹于含青霉素（50ug/ml）的LB琼脂糖培养皿中，37℃培养6.5-7.5h后挑取单克隆细胞加入LB培养液中并37℃，200rpm摇菌13-15h。用质粒小提试剂盒提取质粒后进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切筛选，将筛选出的阳性克隆质粒进行测序，并将序列比对无误的质粒命名为BTG2-pcDNA3.0。

S3. 转染