[发明专利]一株表达非洲猪瘟病毒P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用

说明书

本发明提供一株表达非洲猪瘟病毒P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用，本研究以PRV JS‑2012‑△gI/gE株为基础，利用同源重组的方法，将现今国内流行的非洲猪瘟病毒的主要抗原蛋白(P54蛋白)的基因序列，插入到载体PRV JS‑2012‑△gI/gE疫苗株中，构建出含非洲猪瘟病毒P54基因序列的重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株rPRV JS‑2012‑ΔgE/gI+P54。经PCR及间接免疫荧光验证，插入的非洲猪瘟病毒P54基因在载体病毒PRV JS‑2012‑△gI/gE中能稳定且高效表达。生物学特性进一步表明：重组病毒rPRV JS‑2012‑ΔgE/gI+P54与亲本病毒PRV JS‑2012‑△gI/gE基本相似。

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体地说，涉及一种重组的伪狂犬病病毒rPRV、以及使用该rPRV病毒制备的非洲猪瘟疫苗，更具体的，本发明涉及表达非洲猪瘟病毒P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P54株的构建，及其具体的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV) 引起的一种急性、烈性、接触性传染病。控制ASF疫情，是目前我国兽医工作者的头号工作任务，而猪场作为兽医科技工作者的主战场，亟需高效的 ASF防控技术和有效的ASF防控措施。

ASFV是一种有囊膜、线性双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。其病毒粒子结构较为复杂，由内至外分五层组成：含病毒基因组的类核(nucleoid)、内核心壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(capsid)和外囊膜(outerenvelope)。ASFV基因组全长为170-194kbp，由中央保守区和两端可变区组成，编码151-167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。由于病毒基编码的多基因家族(multigenefamilies,MGF)能够获得或丢失ORFs和病毒基因中或基因间存在的短串联重复序列(shorttandem repeats)出现重复数的变异，不同病毒分离株的基因组长度存在差异。目前，ASFV基因组编码蛋白的数量与功能还不完全清楚。

ASFV易感哺乳动物仅限于猪，不同大小的各种猪，包括家猪、野猪和疣猪。除猪外，ASFV还能感染软蜱，且软蜱在ASFV的传播中发挥重要作用。软蜱和疣猪都是ASFV的自然贮存宿主，维持病毒在自然界中长期存在。病毒在软蜱体内能存活数年，并能垂直传播给子代。疣猪对ASFV具有一定抗性，其感染后不产生临床症状，但能产生长时间的病毒血症，是病毒重要的携带者和传染源。疣猪不能水平或垂直传播ASFV，必需由软蜱介导。但在家猪和野猪群中，ASFV则呈现高度接触性传播，通过猪只间的直接接触或接触感染猪的排泄物及其污染物、感染猪的肉与血液制品及残余物实现病毒的传播。家猪和野猪对ASFV的易感性相似，感染潜伏期通常为4-19天，不同毒力毒株感染呈现出不同的临床症状：强毒株感染引致最急性和急性型病例，死亡率达100％；中等毒力毒株则致亚急性型病例，死亡率为 30-70％。慢性型由弱毒株感染引起，病程可持续5至12个月，不引起猪体内出血，主要表现为皮肤坏死溃疡、关节发炎肿胀、淋巴节增生等症状，生长迟缓甚至消瘦。慢性型患猪在持续感染的过程中，具有传染性，能使接触的易感动物感染。感染潜伏期的猪也具有传染性，在出现临床症状前可能会排毒数小时。康复猪也可能长期带毒，并能传播病毒。ASF对养猪业危害巨大，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。目前，ASF并无有效的疫苗和药物可用于预防和治疗。

疫苗是防控病毒和细菌性传染病的常用技术和高效手段。多种人类传染病和动物疫病，通过疫苗的使用得到有效控制甚至根除。然而，由于ASFV生物学特性复杂，在病毒侵入和诱导免疫保护反应等诸多方面仍未获清晰认知，在近半个世纪的ASF疫苗研究过程中，不同研究小组利用了多种技术方法，但并未研制出安全有效的ASF疫苗。尽管灭活疫苗能诱导产生抗ASFV抗体，但免疫猪并不能抵抗强毒株攻击。即使利用现代佐剂制备ASF灭活疫苗，仍然对同源强毒株的攻毒没有保护作用。